去甲斑蝥素通過調(diào)控miR-182-5p抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲①

楊瑞英 張翠亞 衛(wèi)海寧 李鵬哲 閆宇華 侯風(fēng)敏

(邢臺市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，邢臺 054001)

卵巢癌是一種常見的婦科腫瘤，其惡性程度高且對放化療不敏感[1]。臨床治療以手術(shù)為主，但患者整體預(yù)后較差[2]。去甲斑蝥素(norcantharidin,ND)由斑蝥素衍生而來，為斜方形鱗狀晶體，難溶于水，易溶于丙酮和醋酸乙酯[3]。臨床上用于治療肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌等[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道ND對肝癌、食管鱗癌等細(xì)胞株的形態(tài)、增殖有破壞或抑制作用，可提高癌細(xì)胞呼吸控制率及溶酶體酶活性，干擾癌細(xì)胞分裂，抑制其DNA合成[5]。

現(xiàn)有研究表明，miRNA和LKB1/AMPK在多種惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中均發(fā)揮重要作用[6]。但miRNA和LKB1/AMPK在卵巢癌中的作用鮮有報(bào)道，ND對卵巢癌的作用如何，其是否可通過miRNA和LKB1/AMPK在卵巢癌治療過程中發(fā)揮作用尚未明確。因此本研究以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，探討ND對卵巢癌增殖和遷移的作用及其對miRNA和LKB1/AMPK的作用，以期為ND在臨床上治療卵巢癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 SKOV3細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；si-miR-182-5p由上海吉?jiǎng)P公司提供；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫均購自武漢天根生物有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國 HyClone；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛購自北京碧云天有限公司；p-LKB1、p-AMPK、p65及E-cadhrein、Vimentin、Snail抗體和兔二抗購自英國 Abcam；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Advansta；Transwell小室購自康寧公司；LipofectaminTM2000(Carlsbad,CA)購自Invitrogen。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細(xì)胞增殖 選取對數(shù)生長期細(xì)胞以4×105個(gè)/孔鋪于96孔板。丙酮溶解ND(IC50值為45 μmol/L)，PBS稀釋至不同濃度(10、20、30和 40 μmol /L)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～4 d。結(jié)束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。檢測細(xì)胞CCK-8混合液A450值并分析。

1.2.2Transwell細(xì)胞侵襲 BD膠和培養(yǎng)液1∶9配制，冰上操作，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)水化基底膜 30 min。胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，5×104個(gè)/孔，Transwell小室下室加入培養(yǎng)于10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液600 μl，上室加入200 μl無血清細(xì)胞懸液，接種至 24 孔板。16 h后PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，室溫風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移細(xì)胞，33%乙酸脫色，讀取A570值并分析。

1.2.3qRT-PCR檢測mRNA表達(dá) TRIzol法提取總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為性質(zhì)穩(wěn)定的cDNA。qRT-PCR檢測目的基因相對β-actin表達(dá)水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 10 s;60℃ 20 s；72℃延伸35 s。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對mRNA表達(dá)。引物序列如表1。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 調(diào)整細(xì)胞數(shù)5×104個(gè)/ml，80%細(xì)胞密度時(shí)收集細(xì)胞。ND給藥12 h后， 給藥組SKOV3細(xì)胞加入外源性LKB1/AMPK信號通路激動(dòng)劑GSK621 2 ng/ml以驗(yàn)證ND是否通過LKB1/AMPK信號通路抑制EMT。PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解，30 min后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜成功后脫脂牛奶封閉2 h，PBST清洗，1∶1 000 稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

表1 引物序列

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默miR-182-35p表達(dá) 將細(xì)胞隨機(jī)分配至不同組(3×105個(gè)/組)，以si-miR-182-35p和相應(yīng)陰性對照(miR-NC)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于6孔板，融合至30～40%。每次轉(zhuǎn)染使用si-miR-182-35p和miR-NC各20 nmol/L。

2 結(jié)果

2.1ND抑制SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲 CCK-8結(jié)果顯示10、20、30、40 μmol /L ND對SKOV3細(xì)胞增殖抑制作用均增強(qiáng)(P<0.05)，且30 μmol /L抑制作用最強(qiáng)(圖1A)。Transwell結(jié)果表明30 μmol/L的ND顯著抑制SKOV3細(xì)胞侵襲作用(P<0.05，圖1B)。

2.2ND抑制LKB1/AMPK信號通路并調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá) qRT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ND顯著抑制LKB1/AMPK通路相關(guān)蛋白p-LKB1、p-AMPK和p-p65表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)上調(diào)EMT相關(guān)蛋白E-cadhrein，下調(diào)Vimentin和Snail(P<0.05)，GSK621可以部分抵消ND對LKB1/AMPK信號通路和EMT的抑制作用(P<0.05，圖2)。

2.3GSK621部分抵消ND抑制SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲作用 結(jié)果顯示加入GSK621后，ND對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲抑制作用減弱(P<0.05，圖3)，但依舊強(qiáng)于陰性對照組，提示GSK621可挽回ND對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。

圖1 ND對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲影響Fig.1 Effect of ND on proliferation invasion of SKOV3 cellsNote:A.Proliferation;B.Invasion.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖2 LKB1/AMPK和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of LKB1/AMPK and EMT-related proteinsNote:A.qRT-PCR;B.Western blot.*.P<0.01；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.4ND抑制miR-182-5p表達(dá) qRT-PCR檢測ND給藥后SKOV3細(xì)胞內(nèi)miR-182-5p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ND顯著抑制miR-182-5p表達(dá)(P<0.05，圖4)。

圖4 ND對miR-182-5p表達(dá)影響Fig.4 Effect of ND on miR-182-5p expressionNote:***.P<0.001.

圖5 qRT-PCR驗(yàn)證si-miR-182-5p轉(zhuǎn)染作用Fig.5 qRT-PCR validates si-miR-182-5p transfectionNote:***.P<0.001.

2.5ND通過調(diào)控miR-182-5p抑制LKB1/AMPK信號通路 si-miR-182-5p轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，miR-182-5p的表達(dá)顯著降低(P<0.05，圖5)；p-LKB1、p-AMPK和p-p65表達(dá)隨miR-182-5p沉默而降低(P<0.05)，同時(shí)E-cadhrein上調(diào)，Vimentin和Snail下調(diào)(P<0.05，圖6)。

2.6miR-182-5p促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲CCK-8和Transwell分別檢測si-miR-182-5p SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲能力隨miR-182-5p表達(dá)降低而顯著增強(qiáng)(P<0.05，圖7)。

圖6 si-RNA轉(zhuǎn)染后LKB1/AMPK和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 LKB1/AMPK and EMT-related protein expression after siRNA transfectionNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

圖7 si-miR-182-5p抑制SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲Fig.7 si-miR-182-5p inhibits proliferation and invasion of SKOV3 cellsNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

3 討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌，死亡率位于各類婦科腫瘤首位[7]。由于卵巢位于盆腔內(nèi)，且缺乏典型臨床癥狀，因此很難被發(fā)現(xiàn)。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制目前不甚明確，臨床上主要采用手術(shù)療法[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥斑蝥的提取物斑蝥素對肝癌和肺癌等具有一定的治療作用，而ND是斑蝥素的合成衍生物，現(xiàn)有研究表明其對多種腫瘤的治療作用強(qiáng)于斑蝥素[9]。但ND對卵巢癌的作用及分子機(jī)制尚不明確。本研究以SKOV3細(xì)胞為研究對象，觀察ND對其作用和具體分子機(jī)制。

本研究探討ND對SKOV3細(xì)胞增殖影響，確定ND對卵巢癌細(xì)胞最佳作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 μmol /L ND顯著抑制SKOV3細(xì)胞增殖，臨床上ND給藥劑量為成人5～15 mg/次，3次/d，由小劑量逐漸增量，癌癥晚期患者可用較高劑量，但沒有較為精準(zhǔn)的給藥劑量。通過體外藥物濃度篩選，可初步為臨床癌癥患者給藥劑量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為了研究ND對SKOV3細(xì)胞侵襲作用影響，Transwell小室檢測給藥前后SKOV3細(xì)胞侵襲能力變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 μmol/L ND可顯著抑制SKOV3細(xì)胞侵襲。提示ND對SKOV3細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有抑制作用，但機(jī)制尚未明確。

有研究報(bào)道LKB1/AMPK信號通路在結(jié)腸癌、胃癌和肺癌中被激活，主要通過磷酸化LKB1和AMPK促進(jìn)p65磷酸化，從而調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá)[10]。ND在卵巢癌LKB1/AMPK信號通路是否發(fā)揮同樣作用目前尚不明確。Western blot檢測ND給藥前后SKOV3細(xì)胞LKB1/AMPK信號通路蛋白p-LKB1、p-AMPK及p-p65表達(dá)，qRT-PCR和Western blot檢測ND給藥前后SKOV3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ND顯著抑制LKB1/AMPK信號通路蛋白磷酸化同時(shí)抑制EMT相關(guān)蛋白Vimentin和Snail表達(dá)。挽回實(shí)驗(yàn)表明，GSK621可以部分抵消ND對LKB1/AMPK信號通路和EMT抑制作用，同時(shí)消除ND對SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。說明ND可能通過LKB1/AMPK信號通路抑制SKOV3細(xì)胞EMT發(fā)生。

文獻(xiàn)指出miRNA與LKB1/AMPK信號通路在腫瘤中關(guān)系密切，而miR-182-5p作為一個(gè)促癌因素在多種腫瘤中均有所報(bào)道，但在卵巢癌中的相關(guān)研究較少[11,12]。本研究假設(shè)ND通過抑制miR-182-5p影響LKB1/AMPK信號通路從而激活EMT發(fā)生導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲。為驗(yàn)證該假設(shè)，qRT-PCR檢測ND給藥前后miR-182-5p在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果表明ND顯著抑制miR-182-5p表達(dá)，提示ND對miR-182-5p具有抑制作用，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。miR-182-5p對SKOV3細(xì)胞的影響研究表明其可以促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲。siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默miR-182-5p在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)，Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后LKB1/AMPK信號通路蛋白p-LKB1、p-AMPK和p-p65表達(dá)及EMT相關(guān)蛋白E-cadhrein、Vimentin和Snail表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-LKB1-p-AMPK的磷酸化和p-p65表達(dá)隨miR-182-5p沉默而降低，同時(shí)上調(diào)E-cadhrein下調(diào)Vimentin和Snail。提示ND可能通過抑制miR-182-5p阻滯LKB1/AMPK信號通路和EMT發(fā)生。但本研究主要集中于體外研究，ND對卵巢癌影響的體內(nèi)研究將是課題組下一步的主要工作。