hTERC 基因檢測與HC2、SPR 技術(shù)檢測HPV在宮頸病變中的診斷價值

廖 婧，許長俊，孫春意，潘 景，周紅林，劉 洋

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，云南昆明 650101；2）玉溪市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南玉溪653100，3）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650101）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性患者發(fā)病率較高的生殖道惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全世界CC 發(fā)病率為3.2%[1]，我國發(fā)病率也高達(dá)3.6%[2]，嚴(yán)重?fù)p害全球婦女的身心健康，其主要由高危人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染引起[3]。但絕非所有的HPV 感染都可進(jìn)展至癌前病變及宮頸癌，據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過一半的HPV感染患者可通過自身免疫清除感染，CC 發(fā)病率要顯著低于HPV 感染率，因此推測還有其他因素參與共同導(dǎo)致CC 發(fā)生[4]?，F(xiàn)很多國內(nèi)外學(xué)者[5-6]發(fā)現(xiàn)，在各級宮頸病變中幾乎都伴有人端粒酶基因（human telomerase componentgene，hTERC）的過度表達(dá)，表明其在宮頸惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為宮頸病變明確診斷和評估預(yù)后的標(biāo)志物。

本研究分別采用雜交捕獲II（hybrid captureⅡ，HC2）和等離子諧振法（surface plasmon resonance SPR）檢測HPV 感染情況，同時用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）法來獲取不同宮頸組織中hTERC 基因的表達(dá)情況，從而探討宮頸病變初期普通篩查中hTERC 基因與高風(fēng)險(xiǎn)類型HPV 感染的關(guān)系，為CC 早期診斷、治療提供良好決策。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究已通過醫(yī)院倫理審查委員會審查。研究對象為1 200 名于昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科就診且行宮頸篩查的患者，所有患者均為有性生活史且排除妊娠，無宮頸治療史、放化療史及嚴(yán)重內(nèi)科疾病。所有標(biāo)本均進(jìn)行SPR-HPV、HC2-HPV 及hTERC 基因三項(xiàng)檢測，其中一項(xiàng)結(jié)果提示為陽性的患者行陰道鏡檢查下宮頸活檢，以病理學(xué)結(jié)果作為分組標(biāo)準(zhǔn)，有150 名患者行病理組織檢查，將其分為4 組，即正常組32 例，CINI組38 例，CIN II-CIN III 組66 例，宮頸癌組14例。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)步驟 將細(xì)胞采集刷、HPV 采樣刷先后放入宮頸口，單向旋轉(zhuǎn)3～5 圈后取出，把刷頭置于保存液內(nèi)，標(biāo)記后送檢。HC2技術(shù)的主要步驟：細(xì)胞的裂解、細(xì)胞的雜交、捕獲、信號的擴(kuò)大及信號的檢測。SPR 技術(shù)的主要步驟：DNA 提取純化、PCR 擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物基因型檢測。FISH 檢測：主要參照相關(guān)操作指南進(jìn)行，包括：制作玻璃載片、預(yù)處理及標(biāo)本變性雜交、制備玻片的洗滌及復(fù)染。

1.2.2 結(jié)果判讀 如果含有3 個及以上紅色信號的細(xì)胞核在100 個信號完整細(xì)胞核中的百分比超過規(guī)定閾值（本研究閾值為6.2%），則歸類為hTERC 基因陽性，表示基因有擴(kuò)增。HC2-HPV 技術(shù)屬于半定量檢測，若HR-HPV 負(fù)荷量≥1.0pg/mL 則為HC2-HPV 陽性。SPR-HPV 檢測結(jié)果則由計(jì)算機(jī)自動解釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 軟件包分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)及百分比表示，計(jì)量資料用χ2檢驗(yàn)和秩相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢測中hTERC 基因表達(dá)與宮頸病變的關(guān)系

宮頸病變級別不同，hTERC 基因表達(dá)情況存在顯著差異（χ2=28.90，P=0.000），且隨著宮頸病變程度的加重，hTERC 基因有擴(kuò)增趨勢，見表1。

2.2 hTERC 基因表達(dá)與HPV 感染的關(guān)聯(lián)性

在正常組、CINⅠ、CINⅡ/CINⅢ、CC 組病變程度依次增加的情況下，hTERC 基因的異常擴(kuò)增和HC2-HPV、SPR-HPV 的陽性率之間存在相關(guān)性聯(lián)系（r1=0.538，P1=0.000；r2=0.796，P2=0.000），見表2，提示隨著宮頸病變的升級，不僅有HPV 感染率的上升，hTERC 基因的表達(dá)率也在逐步增加。

表1 150 例患者h(yuǎn)TERC 基因表達(dá)情況與病理分級Tab.1 hTERC gene expressions and pathological grades in 150 patients

表2 兩種檢測方法檢測HPV 情況和hTERC 陽性表達(dá)的關(guān)系［n（%）］Tab.2 Relationship between HPV status and positive expression of hTERC detected by the two detection methods ［n（%）］

2.3 hTERC 基因在HC2-HPV、SPR-HPV 組別中的表達(dá)差異

在HC2-HPV 組中，hTERC 基因的擴(kuò)增在HPV 感染和非感染組之間存在顯著差異（P1=0.000）。同樣的，hTERC 基因表達(dá)在SPR-HPV 感染組和非HPV 感染組之間也存在差異（P2=0.021），見表3。

表3 HC2-HPV 及SPR-HPV 組中hTERC 基因的表達(dá)情況［n（%）］Tab.3 Expressions of hTERC gene in HC2-HPV and SPR-HPV group ［n（%）］

3 討論

CC 是迄今為止病因較為明確的一種婦科惡性腫瘤，現(xiàn)已明確高風(fēng)險(xiǎn)類型HPV 的持續(xù)感染與CC的發(fā)生有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，據(jù)統(tǒng)計(jì)約90%的CC 患者均可發(fā)現(xiàn)HPV 感染[7]，因此，HPV 的檢查對于篩檢宮頸癌具有重大意義。本文提到的雜交捕獲II技術(shù)（HC2-HPV）是FDA 唯一批準(zhǔn)用于臨床檢測HPV 的手段[8]，但其缺點(diǎn)是無法實(shí)現(xiàn)HPV 準(zhǔn)確的分型，無法指導(dǎo)臨床去甄別高危型HPV 的類別，可造成患者不必要的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而等離子諧振法（SPR-HPV）作為一種可鑒別16 種高危和8 種低危HPV 亞型的檢測方法[9]，彌補(bǔ)了前者在HPV 分型上的短板，可幫助臨床醫(yī)生去甄別需要關(guān)注與治療的HPV 感染患者，有助于了解各地區(qū)HPV 亞型的流行病學(xué)特點(diǎn)，對HPV 疫苗的研發(fā)與應(yīng)用具有指導(dǎo)性意義，需要注意的是其特異度和陽性預(yù)測值不甚理想。故基于廣泛性篩查和早期明確診斷的出發(fā)點(diǎn)來看，急需方便、快捷的生物學(xué)指標(biāo)協(xié)同HPV 感染情況來綜合性分析判斷病情，使CC 的早期檢出更精準(zhǔn)，可信度更高。

端粒酶系維持人體基因組穩(wěn)定性的一種核糖核蛋白酶，其在正常組織中表達(dá)較少，而在腫瘤組織中表達(dá)異常[10]。hTERC 基因作為其主要成分之一，通過增強(qiáng)端粒酶活性以使細(xì)胞得到永生，從而成為腫瘤發(fā)生的啟動按鈕。包括CC 在內(nèi)的95%惡性腫瘤細(xì)胞中均可用熒光原位雜交法捕獲到hTERC 基因的異常表達(dá)。本研究結(jié)果表明，hTERC 基因在各宮頸病變分組（從低至高）中的表達(dá)率分別為12.5%、34.21%、53.03%、85.71%，宮頸病變與該基因過度擴(kuò)增有關(guān)，且該基因的擴(kuò)增情況隨著宮頸病變等級的增加而升高，與牛艷昕[11]的結(jié)論相一致，分析可能與該基因激活癌基因及促進(jìn)侵襲分子產(chǎn)生相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)HPV 的感染與hTERC 基因的表達(dá)之間也存在關(guān)聯(lián)性[12]，本研究結(jié)果顯示隨著病理學(xué)分組的升級，hTERC 基因的陽性表達(dá)率和HC2-HPV、SPR-HPV的陽性率均呈上升趨勢，該基因與HPV 感染之間呈現(xiàn)正相關(guān)性，且HPV 陽性組別中hTERC 基因的表達(dá)要顯著高于HPV 陰性組。以上均提示在宮頸病變中hTERC 基因的陽性表達(dá)與HPV 的感染密切相關(guān)，兩者協(xié)同增強(qiáng)端粒酶活性，共同促進(jìn)了宮頸病變的發(fā)生和發(fā)展[13]。因此hTERC 基因有望成為宮頸病變發(fā)展的預(yù)測指標(biāo)。大量學(xué)者[14-15]提出，相比于單獨(dú)檢測hTERC 基因的診斷效能，該基因聯(lián)合其他標(biāo)志物（如HPV、C-myc、FOXM1 等）將會對宮頸癌的診斷更有意義。

綜上，宮頸癌是一種發(fā)病率較高但發(fā)展緩慢的惡性腫瘤，早期的診斷和治療顯得尤其關(guān)鍵，除了應(yīng)用廣泛的HPV 檢測技術(shù)，聯(lián)合篩檢hTERC基因可顯著提高宮頸病變的檢出率和準(zhǔn)確率。隨著對該基因的深入了解和探索，以該基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療理念和藥物在宮頸癌治療前景上表現(xiàn)出極大優(yōu)勢[16-17]，相信hTERC基因今后將在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤診療方面發(fā)揮更大的應(yīng)用價值。