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    咳喘寧對RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠的治療作用及對IL-33表達的影響①

    2020-09-29 12:59:26羅銀河王孟清陳興宇黃凱玲王潤霞江智豪常晨陽
    中國免疫學(xué)雜志 2020年17期
    關(guān)鍵詞:咳喘貨號膠原

    孫 樂 羅銀河 王孟清 陳興宇 李 艷 黃凱玲 王潤霞 江智豪 常晨陽

    (湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙 410000)

    支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病,由多種炎癥細胞和細胞組分參與,其特征為反復(fù)發(fā)作,隨病程延長可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄、氣道重塑等病理改變,急性嚴重發(fā)作時可危及生命。呼吸道合胞病毒(respiratory syncy-tial virus,RSV)是臨床常見的下呼吸道感染病原體,可引起RSV相關(guān)性哮喘[1]。研究發(fā)現(xiàn),哮喘的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的免疫反應(yīng),IL-33是 IL-1 細胞因子家族成員,在免疫反應(yīng)中具有啟動作用[2-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)哮喘急性發(fā)作患者血清中IL-33明顯增高,且與肺功能相關(guān)指標數(shù)值呈負相關(guān)[5];此外,IL-33還能促進激素抵抗哮喘兒童肺組織纖維細胞膠原的表達,全程參與RSV誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生發(fā)展過程[6]。但少有關(guān)于IL-33在RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠血清及肺組織中的表達及咳喘寧對IL-33影響的報道。

    本實驗構(gòu)建RSV哮喘大鼠模型,經(jīng)咳喘寧干預(yù)后,觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn),測定其氣道反應(yīng)性,觀察肺組織病理學(xué)改變,檢測氣道重塑指標和免疫炎癥因子IL-33表達水平,以探究咳喘寧對RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠的治療作用及可能的治療機制。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1實驗動物 SPF級Wistar雌性大鼠60只,28~35 d,體質(zhì)量(100±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SYXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物房。

    1.1.2試劑與儀器 RSV Long株、人喉癌上皮細胞 (Hep-2)由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部病毒學(xué)研究所提供;雞卵清白蛋白(OVA)購自北京 Solarbio公司;咳喘寧口服液:炙麻黃、苦杏仁、生石膏、大青葉、黃芪、桃仁、細茶葉、 甘草由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)[(湘)衛(wèi)藥劑(06)05第085號],100 ml/瓶,含生藥70 g;瑞氏-吉姆薩染液購自北京索寶生物科技有限公司,(貨號:G1040);蘇木素-伊紅染色液(貨號:P032IH)、中性樹膠(貨號:P033IH)購自Auragene公司;二甲苯(貨號:10023418)、無水乙醇(貨號:10009218)購自國藥公司;IL-33酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(貨號:E20181109012)購自上海晶天生物科技有限公司;TRIzol試劑(貨號:R1022)、DS2000 marker(貨號:M1102)、SYBR Green qRCR Mix(貨號:P2092)購自東盛生物公司;Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號:K1622)購自Thermo公司;DEPC購自Sigma公司(貨號:V900882);RT-PCR引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成。S888E 型超聲霧化器購自南京道芬電子有限公司;動物呼吸機、氣道阻力和肺順應(yīng)性軟件分析系統(tǒng)購自美國BUXCO,型號為DHX-50、WBP;YT-6C型生物組織攤烤片機產(chǎn)自湖北孝感;P031IH防脫載玻片購自BurBgene公司;BE41光學(xué)顯微鏡購自Motic公司;MK3型酶標儀購自Thermo公司;16K-R型低溫臺式離心機購自長沙鑫奧儀器公司;722S型分光光度儀購自上海第三分析儀器廠;7300熒光定量PCR儀購自ABI公司;THERM-1000型PCR儀購自Corning公司;DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠公司。

    1.2方法

    1.2.1建立RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠模型 大鼠正常適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,隨機選擇15只作為正常組,余下45只參照文獻[7]制作模型,實驗第1、2天分別滴鼻1.0×106PFU RSV,50 μl/只,同時腹腔注射1%OVA 致敏,0.25 ml/只,正常組給予等體積 Hep-2 滴鼻,腹腔注射生理鹽水0.25 ml/只。處理后正常喂養(yǎng)一周,實驗第9天起,造模大鼠霧化吸入1%OVA激發(fā)哮喘,正常組使用等量生理鹽水霧化,隔天1次,30 min/次,共14 d,霧化激發(fā)階段可觀察到造模大鼠煩躁不安、呼吸急促、頻繁撓鼻、大小便失禁等。實驗第15天,正常組和造模后大鼠各取5只進行氣道反應(yīng)性測定,經(jīng)乙酰膽堿(Ach)激發(fā)后,造模后大鼠的肺阻力(RI)明顯高于正常組(P<0.05),表明造模成功,如圖1。

    圖1 氣道反應(yīng)性檢測示造模成功

    1.2.2氣道高反應(yīng)性測定 給藥前隨機取正常組和模型組大鼠各5只,給藥14 d后各組所有大鼠均進行氣道反應(yīng)性測定。10%水合氯醛腹腔注射麻醉,0.3 ml/100 g。將大鼠固定于鼠板,暴露氣管和頸靜脈,用靜脈留置針行頸靜脈穿刺并固定;V形剪開氣管,使用深靜脈穿刺針改造的氣管導(dǎo)管行氣管插管后連接動物呼吸機,設(shè)置呼吸頻率為75 次/min,吸呼比1∶1,潮氣量8 ml/kg。經(jīng)頸靜脈依次間歇推注生理鹽水、6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml的Ach 0.5 ml,每次間隔約1 min,計算機動物肺功能分析軟件檢測氣道阻力(RL)和用藥后的RL,以RL超過基礎(chǔ)值的2倍以上為停止Ach推注標準,以RL變化代表氣道反應(yīng)性。

    1.2.3分組及給藥 造模成功的大鼠隨機分為模型組、咳喘寧高劑量組、咳喘寧中劑量組和咳喘寧低劑量組,每組10只。正常飼養(yǎng)1周。按臨床量效關(guān)系觀察結(jié)果擬定低、中、高劑量組咳喘寧口服液灌胃濃度分別為0.033 ml/100 g、0.3 ml/100 g和1 ml/100 g,正常組和模型組均灌胃等劑量的生理鹽水。實驗第29天開始給藥,每天1次,共14 d。

    1.2.4行為學(xué)觀察 給藥期間每日觀察各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn),記錄有無哮喘急性發(fā)作,給藥第14天記錄單位時間(1 min)內(nèi)各組大鼠撓鼻和打噴嚏次數(shù)以評價咳喘寧藥物組大鼠哮喘病情有無改善。

    1.2.5HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變 將大鼠肺組織浸入4 %多聚甲醛固定24 h,經(jīng)乙醇脫水后,置于60℃蠟盒內(nèi)浸蠟、包埋、切片,分別于蘇木素和伊紅染液中染色,脫水,中性樹膠固定,封片。將制作好的切片置于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

    1.2.6Masson染色觀察支氣管上皮細胞下膠原沉積 取大鼠肺組織,于氣管內(nèi)注射 4 %多聚甲醛1 ml 后將全肺浸入 4 %多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋、切片,進行Masson′s Trichrome 染色,中性樹膠固封。光鏡下觀察支氣管上皮細胞下膠原沉積情況,其中陽性區(qū)域為藍色。

    1.2.7ELISA檢測血清IL-33水平 最后一次給藥后經(jīng)腹主動脈采血,室溫下靜置20 min,2 500 r/min離心20 min,獲取血清,ELISA試劑盒檢測血清中IL-33水平,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。酶標比色儀測定各反應(yīng)孔OD值(于波長450nm處,標準孔調(diào)零),參照試劑盒提供的標準品繪制曲線并計算血清中IL-33濃度。

    1.2.8qPCR 檢測IL-33 mRNA水平 TRIzol 法提取肺組織總RNA,取少量測定RNA純度及完整性,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后立即進行qRCR定量,設(shè)置20 μl反應(yīng)體系,IL-33上游引物5′-GAAGAGATCCCTGCTTGGCA-3′,下游引物5′-TCCACACCGTCTCCTGATTG-3′。步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。反應(yīng)參數(shù):95℃,3 min;95℃,10 s;60℃,30 s,共40個循環(huán)。參照說明書計算擴增效率,確認各目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率是否一致(接近100%且差距<5%)。使用2-ΔΔCt法行分析基因相對表達量。

    2 結(jié)果

    2.1咳喘寧對哮喘大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響 正常組大鼠精神良好,活動敏捷,呼吸頻率正常;模型組大鼠精神萎靡,蜷縮成團,對外界刺激反應(yīng)遲鈍,皮毛枯糙,實驗期間常有撓鼻、打噴嚏等癥狀,多次哮喘急性發(fā)作,呼吸急促。與模型組相比,咳喘寧組精神狀態(tài)較好,對一般刺激較為敏感,蜷縮成團行為少見,偶有哮喘急性發(fā)作,撓鼻、打噴嚏癥狀減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中咳喘寧高劑量組與模型組的差異最為明顯(P<0.05)。單位時間內(nèi)(1 min)各組大鼠撓鼻、打噴嚏次數(shù)見表1。

    表1 各組大鼠單位時間內(nèi)撓鼻、打噴嚏次數(shù)(次,

    2.2咳喘寧對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)改變的影響 正常組大鼠肺組織和支氣管結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁無明顯增厚,無充血,肺間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肺組織和支氣管結(jié)構(gòu)不完整甚至消失,肺泡壁增厚,支氣管黏膜和血管壁充血明顯,炎癥細胞大量浸潤。與模型組相比,咳喘寧高、中、低劑量組織破壞程度有明顯改善,肺泡壁輕度增厚,支氣管腔無明顯縮窄,較少炎癥細胞浸潤,其中咳喘寧高劑量組的破壞最輕,仍留存完整的肺泡結(jié)構(gòu),支氣管平滑肌皺襞不明顯。見圖2。

    圖2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化(×200)

    2.3咳喘寧對哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性的影響 在不同濃度的Ach激發(fā)下,模型組的氣道阻力明顯高于正常組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);咳喘寧藥物組的氣道阻力均低于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 不同濃度Ach激發(fā)下各組大鼠的氣道反應(yīng)性

    2.4咳喘寧對哮喘大鼠氣道上皮細胞下膠原沉積的影響 Masson染色結(jié)果見圖3,正常組大鼠氣道上皮細胞下膠原沉積極少;模型組氣道上皮細胞下大量膠原沉積,肺組織破壞嚴重,深度藍染; 與模型組相比,咳喘寧低劑量組藍染相對較淺,但仍有較多膠原沉積,咳喘寧中、高劑量組膠原沉積明顯減少,高劑量組改善效果最好。

    圖3 各組大鼠Masson染色結(jié)果(×200)

    2.5咳喘寧對哮喘大鼠血清IL-33和肺組織IL-33 mRNA的表達影響 ELISA和qPCR結(jié)果見表3和表4,其中正常組血清IL-33和肺組織IL-33 mRNA表達最低,模型組IL-33表達顯著升高(P<0.05),與之相比,咳喘寧干預(yù)后大鼠體內(nèi)IL-33表達水平下調(diào),其中以咳喘寧高劑量組的下降最為顯著(P<0.05)。

    表3 各組大鼠血清IL-33水平

    表4 各組大鼠肺組織IL-33 mRNA表達水平

    3 討論

    支氣管哮喘是嚴重威脅人類健康的世界性疾病,急性發(fā)作未得到及時治療可迅速致死,危害極大。但其發(fā)病機制尚不完全明確,臨床使用的藥物療效有限,因此,探究哮喘的發(fā)病機制和尋找有效的新藥具有重要意義。RSV是一種分布廣泛、傳染性較強的 RNA 病毒,流行病學(xué)資料顯示,反復(fù)RSV感染可增加嬰幼兒日后患哮喘的風(fēng)險[8]。病毒感染引起的哮喘與炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān),有研究表明呼吸道合胞病毒感染誘導(dǎo) BALB/c 鼠肺組織巨噬細胞及樹突狀細胞中IL-33 mRNA高表達可增強由RSV 感染引發(fā)的炎癥應(yīng)答[9]。IL-33屬于白介素1家族,主要表達于上皮細胞和內(nèi)皮細胞,可能是一種在細胞受損時向免疫系統(tǒng)發(fā)出危險信號的警報[10]。正常情況下,IL-33并不具有促炎作用,當(dāng)細胞損傷或壞死時,成熟的IL-3395~ 270、IL-3399~270和IL-33109~270釋放到細胞外,與選擇性表達在 Th2 細胞表面的ST2(suppression of tumorigenicity 2)受體結(jié)合激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)Th2細胞分泌效應(yīng)因子,促進炎癥反應(yīng)[11]。同時有研究顯示,抗IL-33可降低疾病各階段的2型炎癥,反向證實了IL-33的促炎作用[12]。IL-33也參與氣道重塑的發(fā)生,Guo等[13]對哮喘患者氣道黏膜活檢組織進行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)受損的氣道上皮細胞和間質(zhì)成纖維細胞高度表達IL-33,HE染色觀察到上皮下纖維化嚴重,基底膜明顯增厚,且增高的 IL-33 水平與基底膜厚度呈正相關(guān)。此外,IL-33 抗體可減少哮喘模型小鼠中 α-SMA 與 Col1 的蛋白表達,緩解哮喘小鼠氣道重塑,因此推測IL-33可能通過上調(diào)α-SMA 與 Col1 蛋白表達誘導(dǎo)氣道重塑[14]。本研究中,與正常組相比,模型組大鼠HE染色病理學(xué)顯示肺組織破壞明顯,Masson染色中支氣管上皮細胞下膠原沉積增多,血清IL-33和肺組織IL-33 mRNA表達顯著升高,IL-33表達水平增高與大鼠肺組織、氣道病理改變嚴重程度的趨勢呈正相關(guān),與已有研究結(jié)果相同。

    中醫(yī)藥治療哮喘療效確切,且副作用少,在哮喘防治方面具有獨特優(yōu)勢[15]??却瓕幱砂l(fā)散表邪的代表方劑五虎湯另加黃芪、大青葉、桃仁三味藥組成,用于治療喘息性疾病。臨床研究和動物實驗均證明咳喘寧治療RSV誘發(fā)哮喘療效顯著,且其治療作用與哮喘發(fā)生發(fā)展的免疫機制相關(guān)[16]。方中麻黃含麻黃堿,可有效舒張支氣管,具有抗炎、抗過敏的作用;苦杏仁能平喘止咳;石膏清瀉肺熱;大青葉具有抗炎抗病毒作用;黃芪扶正祛邪,可增強人體免疫力,抑制病毒;桃仁活血化瘀,緩解炎癥反應(yīng);細茶葉清神化痰;甘草鎮(zhèn)咳平喘,具有抗炎抗過敏作用。

    本研究中,與模型組相比,咳喘寧高、中、低劑量組大鼠的哮喘癥狀、氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑都有不同程度的改善,且高劑量組的治療作用最為顯著,說明咳喘寧對哮喘癥狀緩解的有效性。ELISA法和qPCR分別從蛋白和基因水平檢測IL-33表達,模型組較正常組表達水平顯著升高,說明IL-33參與哮喘的發(fā)生發(fā)展,介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)氣道重塑;經(jīng)咳喘寧治療后,與模型組相比,大鼠血清中IL-33濃度和肺組織IL-33 mRNA表達均下降,其中高劑量組下降最明顯,表明咳喘寧能有效下調(diào)血清中及肺組織中IL-33的表達,減少Th2細胞分泌效應(yīng)因子,減輕免疫炎癥反應(yīng)對氣道上皮細胞和肺內(nèi)皮細胞損傷;減少氣道和肺組織纖維細胞膠原表達,抑制氣道重塑??梢娧迮c肺組織IL-33的表達變化在一定程度上可提示哮喘的病情變化,反映治療效果。

    綜上所述,IL-33與哮喘氣道免疫炎癥反應(yīng)和氣道重塑的發(fā)生關(guān)系密切,在哮喘的診治中,IL-33的表達可為判斷哮喘病情進展及藥物療效提供重要依據(jù)。因此推測,IL-33很可能是治療RSV誘導(dǎo)哮喘的重要靶點,咳喘寧對RSV誘導(dǎo)哮喘的治療作用可能是通過下調(diào)IL-33的表達實現(xiàn)的。

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