PD-L1通過(guò)調(diào)控PKC-α-NF-κB信號(hào)通路延遲膿毒血癥中性粒細(xì)胞凋亡①

羅玉嬌 鄭小莉 羅 波 曾靜媛 左 英

(西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州 646000)

膿毒血癥屬于多因素誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情進(jìn)展迅速，可導(dǎo)致休克或多器官功能衰竭，病死率高達(dá)50%以上[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥誘導(dǎo)機(jī)體免疫抑制所致的炎癥因子過(guò)量產(chǎn)生是其發(fā)生的重要病理生理過(guò)程[2]。多形核性粒細(xì)胞(polymorpho-nuclear neutrophil,PMN)是天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞，在機(jī)體感染病原體時(shí)，PMN可從血管處遷移出并迅速趨化募集至感染部位并吞噬和殺傷病原體，在完成吞噬、滅菌作用后即發(fā)生凋亡，若凋亡延遲，可導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[3]。研究表明，膿毒血癥患者體內(nèi)PMN凋亡受到抑制，且遷移、殺菌等功能降低，可能在膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。程序性死亡配體 1(programmed death ligand 1，PD-L1)是免疫應(yīng)答的協(xié)同抑制分子之一，對(duì)免疫功能起負(fù)性調(diào)控作用[5]。研究顯示敲除 PD-L1基因的膿毒血癥小鼠生存率及細(xì)菌清除率均顯著高于未敲除PD-L1的小鼠[6]。故推測(cè)PD-L1可能是膿毒血癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。本研究通過(guò)分析膿毒血癥患者外周血PMN凋亡及PD-L1表達(dá)、構(gòu)建 PD-L1 質(zhì)粒并建立大鼠膿毒血癥模型，以研究體內(nèi)沉默PD-L1基因?qū)δ摱狙Y大鼠外周血PMN表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1病例選擇及分組 選擇2017年1月～2018年12月于本院住院治療的12例膿毒血癥患者作為膿毒血癥組，其中肺部感染7例，急性腹腔感染2例，頜面部感染2例，感染部位不明但血培養(yǎng)陽(yáng)性者1例。均為年齡為21～75歲的非妊娠患者。所有患者均符合1991年美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)(ACCP)/危重病醫(yī)師協(xié)會(huì)(SCCM)聯(lián)席會(huì)議有關(guān)膿毒血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)選取本院同期行健康體檢的15名健康志愿者對(duì)照組。兩組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬知情同意。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠60只，7周齡，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2018-17。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜節(jié)律每12 h交替，自由飲水和進(jìn)食，所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)。

1.1.3試劑 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、opti-PD-L1 單克隆抗體(Ebioscience公司)；PVDF 膜(美國(guó)Millipore公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(廣州杰特偉生物科技有限公司)；293T細(xì)胞(廣州沛瑜生物制品有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司，中國(guó))；AXIS-SHIELD polymorphprep分離液(北京先明樂(lè)科技發(fā)展有限公司)； FBS(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司)；肝素(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司)；Histopaque 1119、Histopaque 1083(上海北諾生物科技有限公司)；Annexin V-FITC、PI(上海翊圣生物科技有限公司)；TRIzol(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；Cleaved caspase-3、PKC-α及NF-κB抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)；羊抗兔抗體(賽默飛世爾科技有限公司，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1外周血PMN的制備及檢測(cè) 分別于確診6、12 h內(nèi)抽取患者外周空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝后，加入AXIS-SHIELD polymorphprep分離液，采用密度梯度離心法分離患者外周血PMN，采用10%FBS重懸細(xì)胞后，置于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN凋亡率，Western blot檢測(cè)PMN中PD-L1表達(dá)。

1.2.2慢病毒質(zhì)粒的制備 將PD-L1 siRNA序列克隆到紅色熒光蛋白標(biāo)記的載體中，取5 μg剛合成的載體和1 μl慢病毒包裝質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，進(jìn)行腺病毒重組、包裝和擴(kuò)增，生成慢病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，采用0.45 μm醋酸纖維素過(guò)濾器過(guò)濾含有慢病毒質(zhì)粒的上清液，離心，棄上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3分組及模型建立 按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組20只。假手術(shù)組僅開(kāi)腹翻動(dòng)盲腸，不予以結(jié)扎穿孔。模型組采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒血癥大鼠模型，造模前大鼠禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛腹腔麻醉后，切開(kāi)大鼠腹中線(xiàn)，長(zhǎng)約2 cm，分離并找到盲腸后進(jìn)行結(jié)扎，采用9號(hào)針穿刺盲端腸壁2次，留置貫穿盲腸的橡皮片后，擠出少量糞便，還納盲腸，縫合腹壁，待大鼠清醒后，繼續(xù)進(jìn)入代謝籠自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)組按照模型組的方法制備膿毒血癥大鼠模型，在造模前7 d腹腔注射PD-L1 500 μg，注射容積為80 ml/kg，假手術(shù)組及模型組注射等量生理鹽水。

1.2.4外周血 PMN的提取 各組分別于術(shù)后3、6、12 h抽取大鼠下腔靜脈血2.5 ml，肝素抗凝，加入Histopaque 1119和Histopaque 1083后，700 g離心 30 min，抽取PMN 富集層，PBS清洗2次，去除溶解的紅細(xì)胞，PBS清洗1次，采用瑞氏-姬姆薩染色，PMN純度達(dá)到95%以上方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN的凋亡情況 各組分別于術(shù)后6、12 h抽取大鼠下腔靜脈血450 μl，分別加入5 μl液體Annexin V-FITC和50 μl PI，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN凋亡率。

1.2.6Western blot檢測(cè)PMN中Cleaved caspase-3、PKC-α及NF-κB水平 TRIzol法提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入濃度為1∶500的一抗，4℃過(guò)夜；加入1∶1 000的二抗，室溫孵育2 h。ECL發(fā)光法顯色，以β-actin為內(nèi)參，Odyssey掃描系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶灰度值，采用目的條帶灰度值/β-actin灰度值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1外周血PMN的凋亡率 膿毒血癥組患者在6、12 h時(shí)PMN的凋亡率分別為(27.45±2.47)%和(11.45±1.67)%；健康對(duì)照組在6、12 h時(shí)PMN的凋亡率分別為(63.22±2.88)%和(62.69±2.59)%。與健康志愿者相比，膿毒血癥患者在6、12 h時(shí)PMN凋亡水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血PMN的凋亡率

2.2外周血PMN中PD-L1表達(dá) 膿毒血癥患者在6、12 h時(shí)PD-L1表達(dá)水平分別為1.05±0.14和1.28±0.16；健康對(duì)照組在6、12 h時(shí)PMN的PD-L1表達(dá)水平分別為0.42±0.08和0.53±0.11。與健康對(duì)照組相比，膿毒血癥患者在6、12 h時(shí)PD-L1的表達(dá)水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 外周血PMN中PD-L1表達(dá)

2.3膿毒血癥組粒細(xì)胞凋亡率和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性 PMN 6、12 h的凋亡率分別與對(duì)應(yīng)時(shí)段的PD-L1表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.693，P=0.012；r=-0.685，P=0.014)。見(jiàn)圖3。

圖3 膿毒血癥組粒細(xì)胞凋亡率和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

2.4沉默PD-L1基因表達(dá)對(duì)膿毒血癥大鼠外周血PMN凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組6、12 h外周血PMN凋亡率為6.09%及5.91%，顯著低于假手術(shù)組同時(shí)段的22.97%及24.61%(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組6、12 h外周血PMN凋亡率為17.22%及18.65%，顯著高于模型組同時(shí)段的凋亡率(P<0.05)，見(jiàn)圖4A、B。同時(shí)，模型組各時(shí)間點(diǎn)PMN中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)量亦顯著低于假手術(shù)組同時(shí)段(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Cleaved caspase-3表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖4C、D。

圖4 沉默PD-L1基因表達(dá)對(duì)膿毒血癥大鼠外周血PMN凋亡率影響

2.5沉默PD-L1基因表達(dá)對(duì)膿毒血癥大鼠外周血PMN中PKC-α/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 模型組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯增高，顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯降低，顯著低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 沉默PD-L1基因表達(dá)對(duì)膿毒血癥大鼠外周血PMN中PKC-α/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

3 討論

研究表明，膿毒血癥患者發(fā)病早期，內(nèi)毒素可刺激單核-巨噬細(xì)胞活化，導(dǎo)致免疫炎癥瀑布樣連鎖反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)可出現(xiàn)大量未成熟PMN，PMN功能障礙、凋亡延遲，其遷移、細(xì)菌清除及吞噬功能均發(fā)生異常，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)持續(xù)的免疫紊亂及嚴(yán)重感染[7，8]。本研究顯示，與健康志愿者相比，膿毒血癥患者在6、12 h時(shí)PMN凋亡水平顯著降低，提示膿毒血癥患者體內(nèi)PMN的凋亡發(fā)生延遲，可能促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)進(jìn)展，加重膿毒血癥患者的病情，因此，改善患者體內(nèi)PMN的凋亡延遲，可能有利于改善膿毒血癥患者的預(yù)后，提高治愈率。推測(cè)膿毒血癥患者體內(nèi)可能存在一些抑制PMN凋亡的物質(zhì)。

最新研究發(fā)現(xiàn)，PMN表面的協(xié)同抑制分子PD-L1在人體發(fā)生嚴(yán)重感染時(shí)呈高表達(dá)，PMN的活性受到明顯抑制[9，10]。提示PD-L1可能成為膿毒血癥患者的潛在治療靶點(diǎn)，但其與膿毒血癥患者PMN凋亡之間的關(guān)系研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，與健康志愿者相比，膿毒血癥患者在6、12 h時(shí)PD-L1表達(dá)水平顯著提高，且PMN 6、12 h的凋亡率與6、12 h PD-L1表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，提示PD-L1可能是介導(dǎo)膿毒血癥患者外周血PMN凋亡延遲的重要因子。

動(dòng)物研究顯示，相較于野生型小鼠，基因敲除PD-L1的膿毒血癥小鼠生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，炎癥因子表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步提示PD-L1在膿毒血癥的病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用?；诖?，本研究觀察了沉默PD-L1基因?qū)δ摱狙Y大鼠外周血PMN凋亡的影響，結(jié)果顯示，模型組6、12 h血清PMN凋亡率顯著低于假手術(shù)組同時(shí)段水平，且模型組各時(shí)間點(diǎn)PMN中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)量亦顯著低于假手術(shù)組同時(shí)段水平，提示膿毒血癥大鼠體內(nèi)PMN凋亡發(fā)生延遲。而實(shí)驗(yàn)組6、12 h PMN凋亡率顯著高于模型組同時(shí)段凋亡率，且實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Cleaved caspase-3表達(dá)量顯著高于模型組同時(shí)段水平。提示沉默PD-L1基因能夠改善膿毒血癥大鼠PMN凋亡延遲的狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與本研究在膿毒血癥患者體內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，PKC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在炎癥性疾病的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11，12]。當(dāng)PKC-α被激活后，可降解IκBα的磷酸化，從而促進(jìn)NF-κB與抑制性蛋白IκB形成復(fù)合物，使NF-κB磷酸化而進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)TNF-α及IL-1β等炎癥因子釋放，促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，模型組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯增高，顯著高于假手術(shù)組，提示膿毒血癥大鼠PMN中PKC-α/NF-κB信號(hào)通路被激活，促進(jìn)炎癥因子的釋放。但實(shí)驗(yàn)組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯降低，顯著低于模型組，提示沉默PD-L1基因可抑制膿毒血癥大鼠PMN中PKC-α/NF-κB信號(hào)通路的激活。

綜上所述，膿毒血癥患者體內(nèi)PMN凋亡發(fā)生延遲，而PD-L1在膿毒血癥患者中呈高表達(dá)，二者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示PD-L1可能是調(diào)控膿毒血癥患者PMN延遲凋亡的重要分子。同時(shí)，通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)可以得出沉默PD-L1基因能夠改善膿毒血癥大鼠PMN凋亡延遲的狀態(tài)，其機(jī)制可能與抑制膿毒血癥大鼠PMN中的PKC-α-NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。由于研究時(shí)間較短，樣本量過(guò)少，故未進(jìn)行人體內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的檢測(cè)，使研究結(jié)論存在一定的缺陷。在下一步的研究中將和其他研究機(jī)構(gòu)合作進(jìn)行多中心研究，擴(kuò)大病例數(shù)，深入研究影響患者PMN凋亡延遲的具體信號(hào)通路。