豬尿中四種磺胺藥物殘留檢測試劑盒效能評估

王 博 曹向英 孫文梅 張 婧 黃 忠 施蔡培

（1、上海市獸藥飼料檢測所,上海201103 2、上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測中心，上海201611 3、上海市嘉定區(qū)農(nóng)產(chǎn)品檢測中心, 上海201800 4、上海市崇明區(qū)動物疫病預防控制中心,上海202150)

磺胺類藥物是一類人工合成的抗生素，因其抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價格便宜等原因被廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，但是通過動物體內(nèi)殘留轉(zhuǎn)移到人體可能會引起過敏、中毒和導致耐藥性細菌的產(chǎn)生, 還可能引起造血系統(tǒng)障礙等問題[1,2]。我國農(nóng)業(yè)部168號公告[3]中規(guī)定磺胺二甲嘧啶為允許用于防治動物疾病，但僅是通過混飼給藥使用，且規(guī)定其休藥期為15 天。通過對豬屠宰前尿液檢測，能判斷養(yǎng)殖場或養(yǎng)殖戶是否按規(guī)定執(zhí)行休藥期，這對于食品安全來說是非常有必要的。而隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號公告[4]的發(fā)布，促生長類抗生素不得使用，規(guī)范、綠色、健康化養(yǎng)殖是畜牧業(yè)發(fā)展的大趨勢，因此，對于非法添加的監(jiān)控措施愈發(fā)顯得重要。

目前國內(nèi)外檢測磺胺的方法多為液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[5,6]，其因檢測時間短、檢測限低、結(jié)果準確、能大批量處理樣品而被廣泛應用，但缺點是儀器成本高，難以滿足養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)場檢測和推廣使用，因此就需要一種快速、準確、方便、易于推廣的篩查方法。Elisa 快速檢測試劑盒是一種比較適合快篩的工具[7,8]，其使用基礎在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應，方法快速、準確，和質(zhì)譜相比，快速檢測試劑盒成本低、易攜帶，能滿足實際檢測需求，更適合推廣。目前，市面上針對豬尿中磺胺類殘留的檢測試劑盒有多種，但是對于試劑盒實際檢測效果的評價卻沒有，這對于不同地區(qū)對豬尿中磺胺類藥物殘留監(jiān)管是不利的，本文通過考察常見的3 種市售磺胺檢測試劑盒，對3 種試劑盒的各方面效能進行比較，挑選出最為適合日常檢測磺胺的檢測試劑盒，為各地加強監(jiān)管提供參考。本文暫將3 種試劑盒編為試劑盒1，試劑盒2，試劑盒3，其中試劑盒2 為深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磺胺多殘留快速檢測試劑盒。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器。BioTek 酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；BOD-10 低溫恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國) 有限公司；Allegra X-22R 高速冷凍離心機，德國BECKMAN 公司；N-EVAP 水浴控溫氮吹儀，上海安譜公司。

1.1.2 試劑與材料磺胺二甲 (基) 嘧啶標準品，批號:40730，99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺氯噠嗪標準品，批號: 20620，100.0%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺間甲氧嘧啶標準品，批號: 40425，98.0%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺嘧啶標準品，批號: 31010，99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；磷酸氫二鈉，批號：20130719，99.0%，上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀，批號：F20030220，99.5%，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑有限公司；氯化鈉，批號：20140712，99.5%，上海凌峰化學試劑有限公司。

1.1.3 主要試液配制磷酸鹽緩沖液：準確稱取磷酸氫二鈉0.77g、磷酸二氫鉀0.18g 和氯化鈉8.94g，用1000mL 超純水定容混勻，即制得磷酸鹽緩沖液。

1.2 前處理方法試劑盒1，試劑盒2：將樣品離心后，直接取50μL 進行檢測。試劑盒3：將樣品均質(zhì)，取1mL 至試管中，加5mL 乙酸乙酯，混勻后上下顛倒15 分鐘，離心，取1mL 上清液至試管中，50℃條件下氮氣吹干，使用1mL 磷酸緩沖液復溶，吸取100μL 復溶物至試管中，加入300μL 磷酸鹽緩沖液，取50μL 進行檢測。

1.3 檢測方法按照儀器及試劑盒說明書，用配套校準品對試劑盒進行定標，并按照說明書方法對已處理好的樣品進行后續(xù)實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線標準曲線由6 ～7 個濃度組成，重復點樣2次，按4 參數(shù)法進行計算，以吸光度為橫坐標，樣品濃度為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見表1，三種試劑盒均表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性。

2.2 試劑盒靈敏度試劑盒的檢測靈敏度以標準曲線重復測定的50%抑制濃度IC50來表示，見表2，一般來說，IC50數(shù)值越小說明抗體的特異性能越強，如表2 所示，試劑盒3 抗體的特異性能最強，因豬尿中磺胺殘留限量并無相關(guān)標準作出規(guī)定，故參考GB 31650-2019 食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量中規(guī)定：所有食品動物（產(chǎn)蛋期禁用）各靶組織中的最大殘留限量為100 μg/kg，因此，三種試劑盒均能滿足實際檢測需求。

2.3 回收率測定實驗選擇較為常見的磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺嘧啶作為磺胺類混標，通過向空白樣品中添加低中高三個不同濃度的磺胺類混標來考察試劑盒的準確性，每個濃度樣品重復5 次。因試劑盒1 標準曲線范圍為0～40.5μg/L，因此試劑盒1 采取10、25 和40μg/L 三個濃度添加；試劑盒2 和3 則采用10、40 和100μg/L 三個濃度添加。陰性尿樣采自于上海市某豬場，經(jīng)LC-MS/MS 檢測無磺胺殘留，添加回收的檢測數(shù)據(jù)見表3，如表所示，試劑盒2 的回收率為88.2～125.1%，另外兩種試劑盒回收率分別為59.5～71.4%和56.4～73.1%，這可能是三種試劑盒對不同類磺胺的選擇性不同，結(jié)果表明，試劑盒2 對目標磺胺類檢測結(jié)果更準確。

表1 三種試劑盒線性范圍、標準曲線和線性相關(guān)

表2 三種試劑盒的IC50 值（μg/L）

表3 三種試劑盒添加回收率實驗（n=5）

2.4 實際樣品檢測與確證實驗選取上海市某豬廠采集的20批豬尿樣品，用三種試劑盒進行篩查，并對采集來的樣品用質(zhì)譜進行檢測，結(jié)果顯示，樣品中均未檢測出磺胺。

2.5 操作步驟便捷程度此次實驗針對豬尿液中磺胺進行檢測，三種試劑盒均采用一步競爭法，其檢測過程都包含了一步競爭反應和一步顯色反應，但在具體操作上還是具有較大差別，其中試劑盒1 加樣4 次，孵育10 分鐘，顯色10 分鐘；試劑盒2 加樣5 次，孵育30 分鐘，顯色15 分鐘；兩類試劑盒規(guī)定樣品澄清均可直接加樣，操作簡便；試劑盒3 加樣4 次，孵育1 小時，顯色30 分鐘，樣品前處理復雜，操作耗時耗力。

3 結(jié)論

本實驗對市售的三種磺胺檢測試劑盒進行評價，通過對試劑盒標準曲線、靈敏度、回收率、實際樣品的檢測和操作步驟的便捷程度進行考察，結(jié)果表明，試劑盒2，即深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磺胺多殘留快速檢測試劑盒標準曲線、回收率和操作步驟明顯要好于另外兩種試劑盒，靈敏度也能滿足實際檢測需求，實際操作過程中，前處理簡單，能有效避免因操作不當帶來的誤差，因此，推薦其作為豬尿中磺胺殘留檢測的快篩試劑盒。