MALDI-TOF MS檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌及其表型的臨床應(yīng)用研究

李 翔，李慧銘，劉正祥，李 凱，伏建峰△

1.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院消毒供應(yīng)科，新疆烏魯木齊 830000；3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)診斷中心，新疆烏魯木齊 830000；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師哈密紅星醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆哈密 839000

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，因其具有官能團(tuán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染的主要抗菌藥物之一。近年來(lái)，隨著經(jīng)驗(yàn)用藥模式的流行，不合理使用抗菌藥物成為臨床工作中的頻發(fā)事件，導(dǎo)致耐藥、多重耐藥菌株呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重制約和影響感染性疾病患者的有效治療[1-3]。因此，依據(jù)臨床耐藥檢測(cè)數(shù)據(jù)，合理選擇有效的抗菌藥物，可能更能滿(mǎn)足臨床感染性疾病治療所需。

傳統(tǒng)的產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌和表型的檢測(cè)采用改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP和碳青霉烯滅活試驗(yàn)(CIM)等手工、半自動(dòng)檢測(cè)方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；分子生物學(xué)檢測(cè)(如PCR、二代測(cè)序等)，操作難度大、質(zhì)量保證體系難以維系、檢測(cè)平臺(tái)數(shù)據(jù)不一致，也不利于臨床推廣和普及?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)利于保持待測(cè)蛋白質(zhì)片段的完整性，特別適用于混合物及各種分子質(zhì)量生物樣品的測(cè)定，具有精準(zhǔn)、快速的特點(diǎn)[4]?；谂R床抗感染治療現(xiàn)狀，也基于對(duì) MALDI-TOF MS技術(shù)的認(rèn)知，并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究擬采用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌及其表型，以利于及時(shí)、有效地提供與碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥性相關(guān)聯(lián)的臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，旨在為臨床快速、合理、有效地選擇抗菌藥物提供參考依據(jù)，進(jìn)而為感染性疾病患者得到及時(shí)、有效的治療提供支持。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 選取新疆軍區(qū)總醫(yī)院微生物室自2014-2019年臨床標(biāo)本分離的對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌20株、對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物敏感的腸桿菌科細(xì)菌40株，剔除同一患者重復(fù)分離菌株；前期經(jīng)耐藥基因檢測(cè)[5]，確定含有碳青霉烯酶如下：絲氨酸碳青霉烯酶10株、金屬β-內(nèi)酰胺酶6株、苯唑西林酶1株，絲氨酸和金屬β-內(nèi)酰胺酶混合型3株，NDM-1陽(yáng)性對(duì)照菌株為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，以大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照菌株。

1.2主要儀器及試劑 MALDI-TOF MS儀(江蘇天瑞)、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)和比濁儀(法國(guó)生物梅里埃公司)、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀(羅氏480z)、電子天平(德國(guó)賽利多斯公司)、恒溫孵育箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、高速離心機(jī)(中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、亞胺培南藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)、α-氰基-4-羥基肉桂酸HCCA(法國(guó)生物梅里埃公司)、3-氨基苯硼酸(上海麥克林生物技術(shù)有限公司)、EDTA-Na2(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌藥敏檢測(cè) 所有菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)均使用法國(guó)生物梅里埃公司 VITEK 2 Compact及其配套GN16藥敏卡進(jìn)行鑒定，以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，以亞胺培南為碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物觀測(cè)或研究對(duì)象(預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)；采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)復(fù)核亞胺培南MIC值，重新確認(rèn)菌株是否對(duì)亞胺培南敏感或耐藥，藥敏結(jié)果的判讀按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)M100 2019年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.2傳統(tǒng)方法檢測(cè)

1.3.2.1簡(jiǎn)化碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)(sCIM) 挑取單個(gè)待測(cè)菌落，在2 mL TSB中乳化，旋渦振蕩10～15 s，將亞胺培南藥敏紙片加到每個(gè)菌懸液TSB管中，35 ℃孵育4 h；將大腸埃希菌ATCC25922配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海鶆蛲坎加贛-H瓊脂平板上；將TSB中亞胺培南藥敏紙片撈出，貼于已經(jīng)接種好指示菌的M-H平板表面，35 ℃孵育18～24 h后，觀察結(jié)果，結(jié)果依據(jù)CLSI M100 2019年標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.3.2.2紙片抑制增效試驗(yàn)(DSST) 將3-氨基苯酚硼酸(APBA)、EDTA-Na2滴于亞胺培南藥敏紙片上，分別制成亞胺培南/APBA(10 μg/500 μg)紙片、亞胺培南/EDTA-Na2(10 μg/2 μmol)紙片、亞胺培南/APBA+EDTA-Na2(10 μg/250 μg+1 μmol)紙片；將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇郎y(cè)菌懸液均勻涂布在MH胨平板上，分別貼上亞胺培南和復(fù)合藥敏紙片，35 ℃孵育16～18 h后，測(cè)量抑菌圈，以復(fù)合紙片與單藥紙片的抑菌圈之差≥5 mm為陽(yáng)性，觀察結(jié)果。

1.3.3PCR基因檢測(cè)

1.3.3.1待測(cè)菌核酸提取 待測(cè)標(biāo)本接種至血培養(yǎng)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取純化菌落配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海?.5 mL菌懸液，高速離心后取菌體沉淀，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2PCR基因引物 擴(kuò)增包括7種碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaSME、blaIMI、blaVIM、blaIMP和blaOXA-)，PCR引物由新疆子琦生物有限公司委托北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成，具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR基因引物序列

1.3.3.3PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為20 μL。雙蒸水6.2 μL，細(xì)菌 DNA模板3 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，2×qPCR SuperMix 10 μL。

1.3.3.4PCR循環(huán)條件 (1)預(yù)變性：94 ℃ 30 s；(2)循環(huán)：94 ℃ 5 s，50～60 ℃15 s，72 ℃ 10s，40～45個(gè)循環(huán)；(3)延伸：72 ℃ 10 s。

1.3.4MALDI-TOF MS方法檢測(cè)

1.3.4.1內(nèi)部校準(zhǔn) HCCA基質(zhì)進(jìn)行內(nèi)部校準(zhǔn)，參考峰值為130.6 m/z、233.1 m/z、397.5 m/z、524.9 m/z、651.0 m/z、776.1 m/z和901.8 m/z，每個(gè)m/z峰最大偏差不超過(guò)±5 m/z，則視為校準(zhǔn)合格。

1.3.4.2菌懸液與亞胺培南混合液的制備 將待測(cè)菌落配制成2麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，將亞胺培南藥敏紙片配制?.1 mg/mL，分別取20 μL菌懸液(2 McF)與20 μL亞胺培南(0.1 mg/mL)進(jìn)行等體積混合，35 ℃孵育60 min，12 000 r/min離心3 min，備用。

1.3.4.3菌懸液、亞胺培南及抑制劑混合液的制備 將2 McF菌懸液20 μL與0.1 mg/mL亞胺培南20 μL混合，混合液中分別加入4 mg/mL抑制劑(APBA和EDTA-Na2)20 μL，保持總反應(yīng)體積為60 μL，35℃孵育60 min，12 000 r/min離心3 min，備用。

1.3.4.4MALDI-TOF MS檢測(cè)亞胺培南及1.3.4.2和1.3.4.3所制備產(chǎn)物 標(biāo)準(zhǔn)溶液：500 μL乙腈+475 μL水+25 μL三氟乙酸；基質(zhì)溶液：HCCA粉末2.5 mg+250 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液充分溶解；質(zhì)譜參數(shù)：MCP電源1 400 V、靶高壓電源18 800 V、脈沖高壓電源1 320 V、脈沖延時(shí)510 ns、激光強(qiáng)度11%、質(zhì)譜范圍1～1 000 m/z。取1 μL待測(cè)液涂鋼制靶板，待干燥后，加入1 μL基質(zhì)液(HCCA)，干燥后上質(zhì)譜檢測(cè)，手動(dòng)選點(diǎn)，選取至少6點(diǎn)，累計(jì)240張激光照，觀察質(zhì)譜圖，納入條件為單個(gè)質(zhì)量峰大于1 000離子流強(qiáng)度。亞胺培南的特征峰在299 m/z處[6]，將待測(cè)菌與亞胺培南共同孵育一定時(shí)間后，行MALDI-TOF MS檢測(cè)，觀察共同孵育前后抗菌藥物的質(zhì)譜圖變化，若出現(xiàn)原有特征峰的銳減或消失，并伴水解產(chǎn)物的生成，則提示待測(cè)菌產(chǎn)碳青霉烯酶?；诋a(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶細(xì)菌可以被3-氨基苯硼酸化合物抑制而不被EDTA抑制，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌可以被EDTA-Na2抑制但不被硼酸化合物所抑制的原理，分別在MALDI-TOF反應(yīng)體系中添加3-氨基苯硼酸和EDTA-Na2，將待測(cè)菌與亞胺培南共同孵育60 min后，觀測(cè)特征質(zhì)譜峰的變化，以此檢測(cè)區(qū)分產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌表型[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏復(fù)核檢測(cè) 20株碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥菌株的亞胺培南MIC值均≥4，經(jīng)紙片擴(kuò)散法(K-B法)復(fù)核檢測(cè)，復(fù)核率為100.0%，具體如表2。

表2 已知表型耐藥菌株亞胺培南藥敏結(jié)果

2.2傳統(tǒng)檢測(cè)方法

2.2.1sCIM實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，其檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的靈敏度為90.0%、特異度為95.0%、符合率為93.3%(56/60)，以上結(jié)果根據(jù)(CLSI M100)2019標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

2.2.2DSST實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，檢測(cè)出產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶8株(G1、G3、G5～7、G18～20)、產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶6株(G2、G8～11、G13)、混合型1株(G14)，5株無(wú)法判定產(chǎn)何種碳青霉烯酶(G4、G12、G15～17)，表型區(qū)分符合率為75.0%(15/20)。

2.3PCR檢測(cè) PCR共檢測(cè)出KPC-2型10株、NDM-1型6株、KPC和NDM共有型2株(G14)、OXA-48型1株，符合率為100.0%。

2.4MALDI-TOF MS檢測(cè)

2.4.1產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌檢測(cè) 結(jié)果顯示，待測(cè)菌與亞胺培南共同孵育60 min后，行MALDI-TOF MS檢測(cè)，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌的檢出率為98.3%(59/60)，檢測(cè)的靈敏度為95.0%、特異度為100.0%。見(jiàn)圖1。

注：圖中圈的數(shù)據(jù)代表亞胺培南質(zhì)量峰(299.36±1)m/z所在位置。

2.4.2產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌表型區(qū)分檢測(cè) 結(jié)果顯示，檢測(cè)出產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶10株，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶6株，混合型3株，表型檢測(cè)符合率為95.0%(19/20)。見(jiàn)圖2。

注：圖中圈的數(shù)據(jù)代表亞胺培南質(zhì)量峰(299.36±1)m/z所在位置，質(zhì)量峰(299.36±1)m/z消失說(shuō)明亞胺培南被產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌水解，藥效失活；質(zhì)量峰(299.36±1)m/z出現(xiàn)說(shuō)明抑制劑抑制產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌，亞胺培南未被水解，藥效未失活。

2.5MALDI-TOF MS的檢測(cè)效能評(píng)估

2.5.1MALDI-TOF MS方法檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌效能進(jìn)行評(píng)估 對(duì)傳統(tǒng)方法、MALID-TOF MS和PCR檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的效能行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示傳統(tǒng)方法檢測(cè)符合率為93.3%(56/60)，MALID-TOF MS為98.3%(59/60)，PCR為100.0%(60/60)，分別經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)分析，3種方法在檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌效能上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3；在檢測(cè)時(shí)程方面，與傳統(tǒng)方法比較，MALD-TOF MS可提早27 h出具檢驗(yàn)報(bào)告，與PCR比較可提早4 h出具結(jié)果。

表3 3種方法檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌效能比較

2.5.2MALDI-TOF MS方法檢測(cè)碳青霉烯酶表型效能評(píng)估 20株不同基因型別的產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌，傳統(tǒng)方法檢測(cè)符合率為75.0%(15/20)、MALID-TOF MS符合率為95.0%(19/20)、PCR符合率為100.0%(20/20)，傳統(tǒng)方法、PCR和MALID-TOF MS檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在檢測(cè)時(shí)程方面，MALDI-TOF MS可較傳統(tǒng)方法提早17 h出具檢驗(yàn)報(bào)告，比PCR提前3 h。見(jiàn)表4。

表4 3種方法檢測(cè)碳青霉烯酶不同表型檢出符合率比較

3 討 論

MALDI-TOF MS因其具有高靈敏度、分析速度快、分辨率高等特點(diǎn)，特別是近年來(lái)在基因分型分析、病原體鑒定、質(zhì)譜成像等應(yīng)用的發(fā)展，已成為目前微生物鑒定工作中重要的組成部分，2012年獲中國(guó)CFDA批準(zhǔn)，2013年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，微生物臨床檢驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)入質(zhì)譜時(shí)代。本研究以臨床常用的碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物為觀察對(duì)象，評(píng)估MALDI-TOF MS在病原菌耐藥性檢測(cè)方面應(yīng)用的可行性。業(yè)已證實(shí)，碳青霉烯耐藥菌所產(chǎn)碳青霉烯酶，可作用于碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的官能團(tuán)，即β-內(nèi)酰胺環(huán)，通過(guò)水解作用，打開(kāi)酰胺鍵，使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)放，致使抗菌藥物官能團(tuán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受損，進(jìn)而致藥效失活，被認(rèn)為是病原菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制?；谝陨险J(rèn)知，本研究將待測(cè)菌與碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物共同孵育，之后行MALDI-TOF MS檢測(cè)，觀察共同孵育前后抗菌藥物的質(zhì)譜圖m/z的變化，如果待測(cè)菌對(duì)抗菌藥物耐藥，則可出現(xiàn)原有特征峰的銳減或消失；理想的條件下，還可伴有新產(chǎn)物的生成。

前期實(shí)驗(yàn)中，本課題組遴選碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物代表性藥物厄他培南475.5 m/z、亞胺培南299.36 m/z和美羅培南383.46 m/z為初步觀測(cè)對(duì)象。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，美羅培南質(zhì)譜特征峰在383 m/z處，與基質(zhì)峰398 m/z接近，檢測(cè)易受干擾；厄他培南質(zhì)譜峰多而雜，增加實(shí)驗(yàn)判斷難度；與前兩者相比，亞胺培南特征峰在299 m/z處，峰形為清晰的單峰，因此，選擇亞胺培南為下一步觀測(cè)研究的對(duì)象[8]。將待測(cè)菌與亞胺培南共同孵育60 min后，行MALDI-TOF MS檢測(cè)，以亞胺培南特征峰的銳減或消失為評(píng)判指標(biāo)。結(jié)果顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌的檢出率、靈敏度和特異度分別為98.3%、95.0%和100.0%；檢測(cè)時(shí)限比傳統(tǒng)方法上提早27 h，比PCR提早4 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未觀測(cè)到水解產(chǎn)物峰的出現(xiàn)，分析原因，可能與反應(yīng)體系的組成和水解產(chǎn)物不易捕獲有關(guān)。SPARBIER等[9]的研究也出現(xiàn)類(lèi)似情況，該項(xiàng)研究認(rèn)為未觀測(cè)到水解產(chǎn)物峰系實(shí)驗(yàn)環(huán)境、反應(yīng)體系pH、實(shí)驗(yàn)材料及其濃度選擇等因素所致。

如前所述，碳青霉烯酶是指能夠水解碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺酶，其可隨細(xì)菌胞體內(nèi)氨基酸位點(diǎn)的位移而產(chǎn)生出不同的表型，每種表型的耐藥特點(diǎn)、細(xì)菌分布、暴發(fā)流行趨勢(shì)和臨床治療用藥方案各不相同，因此，耐藥性細(xì)菌表型的檢測(cè)也是臨床合理用藥的一項(xiàng)重要實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。本研究在MALDI-TOF MS反應(yīng)體系中添加3-氨基苯硼酸和EDTA-Na2，將待測(cè)菌與亞胺培南共同孵育60 min后，觀測(cè)特征質(zhì)譜峰的變化，以此檢測(cè)區(qū)分產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌表型。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)方法、MALDI-TOF MS和PCR用于表型檢測(cè)的符合率分別為75.0%(15/20)、95.0%(19/20)和100.0%(20/20)，檢測(cè)符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但檢測(cè)時(shí)程MALDI-TOF MS比傳統(tǒng)方法提早17 h，比PCR提前3 h。因各基因型別的菌株樣本量有限，本研究未對(duì)具體的型別，如KPC-2型、NDM-1型和OXA-48型等的檢測(cè)效能進(jìn)行評(píng)估和分析。

綜上所述，傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；PCR操作難度大，質(zhì)量不統(tǒng)一，難以滿(mǎn)足臨床快速檢測(cè)并出具病原菌耐藥檢測(cè)結(jié)果的需求。MALDI-TOF MS技術(shù)的應(yīng)用雖尚處于探索研究階段，但其快速、精準(zhǔn)的特點(diǎn)已被各國(guó)研究者接受，并達(dá)成共識(shí)。本研究評(píng)估了MALDI-TOF MS檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌和表型的臨床應(yīng)用可行性，結(jié)果顯示MALDI-TOF MS檢測(cè)效能與其他兩種方法相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)程大幅縮短，可提前出具耐藥檢測(cè)報(bào)告，利于感染性疾病的早期診療[10-12]。當(dāng)然，本研究涵蓋的碳青霉烯酶表型種類(lèi)和數(shù)量有限，如IMP、SME、VIM、IMI等表型在本研究中未涉及，OXA數(shù)量少等[13]，加上在產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科檢測(cè)過(guò)程中尚難捕獲水解產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物的生成，表明反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件的選擇還需進(jìn)一步優(yōu)化、整合和完善[14]。但以上局限和不足均不影響MALDI-TOF MS作為一種快速、有效的病原菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)在臨床的推廣應(yīng)用。