惡臭假單胞菌降解光氧化褐煤工藝條件優(yōu)化

李建濤，劉向榮，徐 杰，莊肅凱

(1.商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054；3.陜西省尾礦綜合利用重點實驗室，陜西 商洛 726000)

我國是煤炭大國，探明儲量位居世界第三，其中褐煤已探明保有儲量達1 303億t，占全國煤炭儲量近13%[1]。褐煤由于水分、灰分和揮發(fā)分含量高，熱值低，氮、硫及重金屬含量高，直接燃燒熱效率低，污染極大，故對褐煤進行清潔高效利用勢在必行[2-3]。煤的微生物降解在低階煤的清潔高效利用方面具有廣闊的發(fā)展前景，經(jīng)過近40年的發(fā)展，煤的微生物降解技術(shù)取得了一定的成果，但也存在很多難題，其中最主要的問題是微生物對煤的降解率低及高效降解菌株缺乏普適性[4-5]。鑒于此，作者篩選降解光氧化褐煤的優(yōu)勢菌株，并通過單因素實驗優(yōu)化優(yōu)勢菌株降解光氧化內(nèi)蒙古勝利褐煤的工藝條件，為低階煤的分級降解方法的建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗

1.1 煤樣與儀器

內(nèi)蒙古勝利褐煤(SLH)、云南昭通褐煤(ZTH)、山西渾源褐煤(HYH)、內(nèi)蒙古元寶山褐煤(YBH)，經(jīng)前處理得到粒度均為(-0.15+0.075) mm 的煤樣。

旋轉(zhuǎn)SW-CJ-1FD型單人單面超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-F100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉豪誠實驗儀器制造有限公司；BC-360型生化培養(yǎng)箱，蘇州威爾實驗用品有限公司；TU-1900型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；XMB-70A型棒磨機，武漢探礦機械廠；CTDG-200875型密封對輥破碎機，徐州威科科技有限公司；F2KA56960型超純水儀，美國Millpore公司。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PSA)、黃桿菌(Flavobacteriumsp.，F(xiàn)LS)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，BAS)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa，PAP)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida，PSP)、金色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，STA)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.4～7.6。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂15 g。

1.3 褐煤的光氧化預(yù)處理

采用旋轉(zhuǎn)床光化學(xué)反應(yīng)器[6]對褐煤進行光氧化預(yù)處理，預(yù)處理條件[7]為：煤加量20 g、煤樣粒度(-0.15+0.075) mm、紫外光強度150 W、馬達轉(zhuǎn)速120 r·min-1、氧化時間42 h、通氧時間40 min。分別得到光氧化內(nèi)蒙古勝利褐煤(GSLH)、光氧化云南昭通褐煤(GZTH)、光氧化山西渾源褐煤(GHYH)和光氧化內(nèi)蒙古元寶山褐煤(GYBH)。

1.4 菌株的活化及復(fù)壯

將4 ℃斜面保藏的菌株P(guān)SA、FLS、BAS、PAP、PSP和STA分別接種至裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于30 ℃、振蕩頻率160 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。在預(yù)先倒好的LB固體培養(yǎng)基平板上分別劃線，于30 ℃、相對濕度80%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；觀察無雜菌后，用接種針挑取少量菌體放入50 mL無菌水中充分振蕩，接種環(huán)蘸取一孔接種于裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于30 ℃、振蕩頻率160 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；用接種環(huán)蘸取一孔接種至裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30 ℃、振蕩頻率160 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，得6種菌液作為種子液。

1.5 降解光氧化褐煤的優(yōu)勢菌株的篩選

取試管若干，每個試管裝LB液體培養(yǎng)基20 mL。除無菌空白對照(BC)以外的試管，分別用接種環(huán)蘸取復(fù)壯好的6種菌液一孔逐個接種，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，于30 ℃、160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)基變渾濁，分別加入粒度為(-0.15+0.075) mm的光氧化褐煤(0.2±0.0002) g，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d，設(shè)3組平行實驗。培養(yǎng)結(jié)束后，降解液于10 000 r·min-1離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，以去離子水為參比，測定450 nm處吸光度(A450)，以3組平行實驗的A450平均值為指標來評價降解效果[8-10]。A450值最大者為降解光氧化褐煤優(yōu)勢菌株，用于后續(xù)實驗。

1.6 單因素實驗

采用單因素實驗，在煤樣粒度為(-0.15+0.075) mm、液體培養(yǎng)基為20 mL、降解溫度為30 ℃的條件下，考察煤加量(0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g)、接種量(0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL)、培養(yǎng)箱振蕩頻率(60 r·min-1、110 r·min-1、160 r·min-1、210 r·min-1、260 r·min-1)、降解時間(6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d)對GSLH降解效果的影響。培養(yǎng)結(jié)束后，降解液于10 000 r·min-1離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，以去離子水為參比，測定450 nm處的吸光度(A450)，以3組平行實驗的A450平均值為指標來評價降解效果。A450值越大，表明降解效果越好。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解光氧化褐煤的優(yōu)勢菌株的篩選

6種細菌對光氧化褐煤的降解效果見圖1。

由圖1可知，6種細菌對4種光氧化褐煤均有不同程度的降解，對GSLH的降解能力強弱順序為PSP>PSA>PAP>FLS>BAS>STA，對GZTH的降解能力強弱順序為PSP>PSA>PAP>BAS>FLS>STA，對GHYH的降解能力強弱順序為PSP>PSA>STA>PAP>BAS>FLS，對GYBH的降解能力強弱順序為PSP>PSA>PAP>BAS>FLS>STA。通過比較，6種細菌中，降解4種光氧化褐煤能力最強的均為PSP。因此，確定PSP為降解光氧化褐煤的優(yōu)勢菌株，其形貌見圖2。

圖1 6種細菌對光氧化褐煤的降解效果Fig.1 Degradation effect of 6 bacteria on photooxidized lignite

圖2 惡臭假單胞菌中的固體培養(yǎng)(a)和液體培養(yǎng)(b)形貌Fig.2 Morphology of Pseudomonas putida in solid medium(a) and liquid medium(b)

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 煤加量對降解液吸光度的影響(圖3)

圖3 煤加量對降解液吸光度的影響Fig.3 Effect of lignite dosage on absorbance of degradation liquid

由圖3可知，隨著煤加量的增加，降解液的A450值先增大后減小，當煤加量為0.3 g·(20 mL)-1時，A450值達到最大，為5.052；繼續(xù)增加煤加量，A450值急劇下降。故最佳煤加量為0.3 g·(20 mL)-1。

2.2.2 接種量對降解液吸光度的影響(圖4)

圖4 接種量對降解液吸光度的影響Fig.4 Effect of inoculation size on absorbance of degradation liquid

由圖4可知，隨著接種量的增加，降解液的A450值迅速增大，當接種量達到2.0 mL·(20 mL)-1時，降解液的A450值達到5.234；繼續(xù)增加接種量，A450值變化不大。故最佳接種量為2.0 mL·(20 mL)-1。

2.2.3 培養(yǎng)箱振蕩頻率對降解液吸光度的影響(圖5)

圖5 培養(yǎng)箱振蕩頻率對降解液吸光度的影響Fig.5 Effect of incubator oscillation frequency on absorbance of degradation liquid

由圖5可知，隨著培養(yǎng)箱振蕩頻率的增大，降解液的A450值先增大后減小，當培養(yǎng)箱振蕩頻率為210 r·min-1時，A450值達到最大，為5.395。當培養(yǎng)箱振蕩頻率為160 r·min-1時，降解液的A450值為5.357，與培養(yǎng)箱振蕩頻率為210 r·min-1時差別不大，考慮到節(jié)能，故最佳培養(yǎng)箱振蕩頻率為160 r·min-1。

2.2.4 降解時間對降解液吸光度的影響(圖6)

由圖6可知，隨著降解時間的延長，降解液的A450值逐漸增大，當降解時間達到12 d時，降解液的A450

圖6 降解時間對降解液吸光度的影響Fig.6 Effect of degradation time on absorbance of degradation liquid

值為5.252；繼續(xù)延長降解時間，降解液的A450值變化不大。故最佳降解時間為12 d。

3 結(jié)論

從6種細菌中篩選出降解光氧化褐煤的優(yōu)勢菌株為惡臭假單胞菌，并通過單因素實驗優(yōu)化了惡臭假單胞菌降解光氧化內(nèi)蒙古勝利褐煤的工藝條件。確定惡臭假單胞菌降解光氧化內(nèi)蒙古勝利褐煤的最佳工藝條件為：煤加量0.3 g·(20 mL)-1、接種量2.0 mL·(20 mL)-1、培養(yǎng)箱振蕩頻率160 r·min-1、降解時間12 d、煤樣粒度(-0.15+0.075) mm、降解溫度30 ℃。