基于網絡藥理學與分子對接研究四逆散治療肝癌的作用機制

李 菁，莫嘉浩，許洪彬，朱俊霞，史佩玉，邢萬里，鐘 崇，林麗珠

1 廣州中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，廣州 510000； 2 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，長沙 410007；3 廣州中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院，廣州 510405； 4 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510000

原發(fā)性肝癌指發(fā)生于肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤[1]，位列致死性惡性腫瘤第三名[2]。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病人數(shù)約占全球的一半，且仍呈上升的趨勢[3]。西藥在病情緩解、提高生存質量和延長生存時間等方面沒有顯著優(yōu)勢[4]，而中醫(yī)藥治療肝癌的臨床療效顯著，并且可以減少腫瘤復發(fā)和轉移，延長患者的生存時間，改善生存質量[5-6]。作為《傷寒論》的名方，四逆散由柴胡、芍藥、枳實、甘草組成，具有解郁疏肝理脾之效[7]?，F(xiàn)代研究[8]也表明，四逆散可抑制攜帶人肝癌基因的裸鼠的移植瘤生長，通過增強其氧化應激能力以促進凋亡。但因四逆散化學成分復雜，目前的研究對于四逆散治療肝癌的完整的藥效機制尚未明確。

網絡藥理學基于“化合物-靶點-通路-疾病”的相互作用網絡，探究四逆散中潛在有效物質與核心治療靶點，與中醫(yī)的整體觀念相符。而分子對接方法是一種基于配體-受體理論，通過化學計量學方法來模擬小分子配體與蛋白受體的幾何匹配、能量匹配，以進行分子間相互作用識別并預測受體-配體復合物結構的一種方法，可用于研究成分與靶點的相互作用[9-10]。因此，本文擬聯(lián)合網絡藥理學-分子對接以探究四逆散抗肝癌的有效物質、核心治療靶點通路及分子機制，為進一步的實驗研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 四逆散化合物與靶標獲取 運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別查找柴胡、枳實、白芍、甘草，獲取相應的化合物。以口服利用度(oral bio-availability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為條件進行化合物篩選，并運用TCMSP查找篩選所得化合物對應的靶標信息，將所得靶標信息輸入Uniprot(http://www.uniprot.org/)獲取靶標對應的基因Symbol。

1.2 肝癌疾病基因獲取 以“hepatocellular carcinomas”、“l(fā)iver cancer”、“hepatoma”、“hepatic cancer”、“hepatic carcinoma”為關鍵詞從人類基因數(shù)據庫獲取肝癌的疾病基因，與四逆散的靶標基因對比后篩選出二者之間的交集基因。

1.3 構建“中藥-化合物-治療靶標”網絡圖 獲取交集基因后，對化合物進行反向篩選，剔除靶標基因中不含交集基因的化合物，運用Cytoscape3.7.1軟件繪制“中藥-化合物-治療靶標”網絡圖，根據軟件所提供的“network analyzer”板塊進行網絡拓撲學分析。

1.4 蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將所得交集基因輸入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據分析平臺進行PPI網絡分析，數(shù)據分析模式設定為“Multiple proteins”，物種限制為“Homo sapiens”。對數(shù)據進行預讀后將置信度設置為≥0.900，并隱藏孤立蛋白，構建PPI網絡，利用Cytoscape3.7.1軟件對結果進行可視化。

1.5 GO富集以及KEGG通路富集分析 利用R studio軟件的cluster profiler包對治療靶標進行GO和KEGG富集分析，并利用ggplot2包對結果進行可視化。其中輸出GO富集條形圖展示生物進程、細胞組成、分子功能前十條富集結果。KEGG富集分析先計算靶標集合的每條富集通路的P值(使用Bonferroni法進行校正，P<0.01被認定是富集顯著，P值越小富集越顯著)，輸出KEGG富集氣泡圖。

1.6 活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證 在上述活性成分與核心靶點篩選結果的基礎上，選擇靶點數(shù)目最多的活性成分作為配體，取PPI網絡中“Degree(度值)”最大的靶點作為受體，進行分子對接。步驟如下：查閱文獻，確定需要對接的蛋白晶體結構域，從PDB網站(https://www.rcsb.org/)下載需要對接的蛋白，利用軟件PyMol_2.3.0分離配體、受體并去除二者的水分子，將二者導入AutoDockTools_1.5.6并保存為“pdbqt”格式，設置蛋白原配體為對接盒子中心，其盒子大小設定為40×40×40，格子間距設定為0.375A，其余參數(shù)均設置為默認值，將下載好的蛋白文件、配體文件、化合物文件導入AutoDock Vina_1.1.2進行分子對接準備，結果導入DISCOVERY STUDIO軟件進行結構預處理，并輸出2D結構圖，導入，最后導入PyMol_2.3.0處理數(shù)據，輸出3D結構圖。

2 結果

2.1 四逆散化學成分及靶標篩選結果 以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，并對不滿足條件但已有文獻[11-13]報道具有明顯藥理活性的化合物進行補充(補充了柴胡皂甙a、柴胡皂甙D)，去重后共得到141種活性成分，轉換去重后共得到中藥靶標基因394個；從數(shù)據庫獲得肝癌疾病基因共565種，取交集后有91個基因重合，為潛在靶標基因，詳見圖1。剔除不含交集基因(靶標)的化學成分后，篩得相關化學成分141種，其中柴胡19種，枳實23種，甘草93種，白芍13種，以柴胡為例，見表1。

2.2 “中藥-化合物-治療靶標”網絡構建 基于91個重合基因相對應的化合物及中藥，構建“中藥-化合物-治療靶標”網絡，并利用Cytoscape軟件對網絡進行可視化，見圖2。圖中三角形、正方形、圓形分別代表中藥、化合物、治療靶標；綠色、紅色、深藍、黃色分別代表甘草、白芍、柴胡、枳實及其化合物，紫色代表治療靶標，褐色為柴胡和甘草共有的化合物，淺藍代表甘草和柴胡和白芍共有的化合物，褐色是枳實和甘草共同的化合物；節(jié)點的大小代表Degree的大小，按度值排序，前二的化合物是山柰酚與槲皮素。

2.3 PPI網絡圖構建 將治療靶點導入string在線數(shù)據庫，設置highest confidence(0.900)，并去除游離靶點后，構建PPI網絡，利用Cytoscape對結果進行可視化(圖3)。圖中節(jié)點大小代表Degree，根據Degree進行排序，數(shù)值較大的前20位為關鍵基因(表2)。

表1 四逆散活性成分基本信息表(以柴胡為例)

2.4 GO和KEGG功能富集分析 共得到GO富集條目1007條，KEGG富集結果102條。GO富集條形圖展示生物進程、細胞組成、分子功能，CC，MF前十條富集結果(圖4)。KEGG富集分析先計算靶標集合的每條富集通路的P值(使用Bonferroni法進行校正，P<0.01被認定是富集顯著，P值越小富集越顯著)，對P值排序后取前15名進行分析(表3)，并繪制KEGG氣泡圖展示富集通路結果(圖5)。此外，對KEGG結果進行預讀后發(fā)現(xiàn)，與四逆散治療肝癌密切相關的通路有乙型肝炎通路、丙型肝炎通路、PI3K-Akt信號通路。

2.5 活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證 以上結果顯示，槲皮素是預測靶點最多的活性成分，TP53為PPI 網絡中 Degree最大的靶點，且經“中藥-化合物-治療靶標”網絡圖可知槲皮素與TP53存在相互作用。為進一步探究二者分子層面的相互作用位點，選擇兩者分別作為分子對接的配體和受體。

搜索查閱文獻后發(fā)現(xiàn)，TP53所表達的蛋白P53對腫瘤細胞具有抑制生長、促進凋亡的生物學功能[14]，P53容易突變是引起近半數(shù)癌癥的原因[15]，新近國外研究[16]發(fā)現(xiàn)6GGA、6GGB、6GGC、6GGD、6GGE、6GGF等結合后穩(wěn)定且可正常運作，故可通過穩(wěn)定P53-Y220C突變體以抗癌，由于均是同一個活性位點，故取6GGA進行分子對接驗證。從PDB網站(https://www.rcsb.org/)下載槲皮素三維結構(圖6)。經對接，結果顯示槲皮素能穩(wěn)定地對接到TP53蛋白結構6GGA的活性口袋中，通過氨基酸殘基VAL147、THR150發(fā)生π-σ鍵作用；通過CYS220發(fā)生π-硫鍵作用；通過GLU221發(fā)生π-氨基鍵作用，通過PRO222、PRO223、PRO151發(fā)生π-烷基作用。槲皮素與TP53(6GGA)分子對接2D結構結果見圖7，3D結構顯示結果見圖8。

表2 排名前20的關鍵基因

3 討論

四逆散為仲景名方，方中柴胡辛散、芍藥酸收、甘草甘緩，三藥配伍共奏調肝用、補肝體、防肝變之效[17]，在抗肝癌的臨床研究[18-20]使用頻繁。但目前針對四逆散治療肝癌的網絡藥理學與分子層面的研究尚有欠缺。因此，本研究擬聯(lián)合網絡藥理學-分子對接以進行成分-靶點-通路-分子結合的研究思路，探究四逆散治療肝癌的機制，為臨床研究奠定基礎。

表3 前15位KEGG通路富集表

經過篩選與取交集后，獲得治療靶標基因91個，最終篩得潛在化合物141種，其中部分化合物的有效性及作用機制已被證實。在潛在化合物中，柴胡、白芍、甘草均富含山柰酚；而柴胡、甘草均含有槲皮素，上述兩種化合物均處于網絡圖的核心，并具有較高Degree，提示這些化合物對應的靶標基因可能在四逆散抗肝癌過程中起主要作用。查閱相關文獻可知，山柰酚為常見的黃酮類化合物，有國外研究[21]發(fā)現(xiàn)，山柰酚可抑制HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲以調節(jié)肝癌的進程；而槲皮素作為一種強大的自由基清除劑，經證實亦可調節(jié)TP53以抑制肝癌細胞增殖，與本研究PPI網絡所得的關鍵基因靶點結果一致[22]。

提取活性成分與交集靶標基因后，由PPI網絡圖可知TP53、HSP90AA1等靶標為其中心，提示其可能是核心治療靶標。其中TP53突變在HBV感染導致的肝癌中有重要意義[23]，其HBV致癌通路也是本研究后續(xù)的KEGG通路富集結果之一；有新近研究[24]發(fā)現(xiàn)HSP90AA1在中重度抑郁組肝癌患者中呈高表達，且與肝癌患者的腫瘤臨床分期存在一定相關性[25]。

GO功能富集結果主要集中在蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶活性調控、細胞應激反應等過程，而KEGG通路富集結果顯示，四逆散主要作用于乙型肝炎通路、丙型肝炎通路、PI3K-Akt信號通路等。其中蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶的過度表達跟肝癌的發(fā)生、分化、轉移進程高度相關[26]；根據肝癌防治專家指南與近期研究[27-28]，乙型肝炎與丙型肝炎是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要病因之一，結合本研究的分析結果，乙型肝炎通路確是四逆散防治肝癌發(fā)生發(fā)展的重點；根據基因學研究[29]顯示，治療丙型肝炎相關性肝癌可通過調控CCND1靶點以調節(jié)腫瘤細胞的分化，而CCND1也是前述PPI網絡中的核心靶標之一；PI3K-Akt信號通路參與細胞的生長、增殖、凋亡等過程，對多種癌癥存在著重要的調控作用[30]。

基于前述結果，本研究選取預測靶點最多的活性成分槲皮素作為配體，發(fā)現(xiàn)其能穩(wěn)定地對接到Degree最大的關鍵靶點TP53的抗癌相關蛋白結構(PDBID：6GGA)上，二者通過氨基酸殘基VAL147、THR150發(fā)生π-σ鍵作用；通過CYS220發(fā)生π-硫鍵作用；通過GLU221發(fā)生π-氨基鍵作用，通過PRO222、PRO223、PRO151發(fā)生π-烷基作用。TP53亦稱P53，是一種抑癌基因，其參與槲皮素調控肝脂肪變性進程中線粒體自噬及穩(wěn)態(tài)維持[31]，而肝脂肪變性是正常肝組織癌變的其中一個重要過程；另有藥理學實驗[32]證實，槲皮素可誘導P53非依賴的G2/M細胞周期阻滯以及促進細胞的凋亡進程以抑制人肝癌細胞增殖，均與本研究的分子對接驗證結果相符。

綜上所述，本研究通過聯(lián)合網絡藥理學分析與分子對接驗證，發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚為四逆散的主要活性成分，以TP53、HSP90AA1等為核心靶標，涉及抗氧化反應、蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶活性調控等多個生物過程，并通過調控乙型肝炎通路、PI3K-Akt信號通路以防治肝癌，可與新近的關于四逆散中“白芍-柴胡”藥對治療肝癌的研究結果互相印證[33]，但該研究僅停留在傳統(tǒng)網絡藥理學的靶標通路，缺少在分子層面的抗癌蛋白結構域研究，故本研究最終通過分子對接驗證了槲皮素-TP53的VAL147、CYS220、GLU221、PRO222等靶蛋白晶體結構域的協(xié)同抗癌效應，為后續(xù)分子層面的中藥抗癌研究提供理論支持。