大腸桿菌與腸道沙門菌混合感染朗德鵝的診斷分析

蘭仕梅，王方國(guó),2，張曉亮，袁婷,3，陳勝利，儲(chǔ)岳峰*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610000；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832001)

朗德鵝，又名西南灰鵝，原產(chǎn)于法國(guó)西部，世界著名肥肝生產(chǎn)的優(yōu)秀品種[1]。因該品種鵝的肥肝營(yíng)養(yǎng)豐富，質(zhì)地細(xì)膩，味道獨(dú)特，被譽(yù)為“世界綠色食品之王”。盡管集約化養(yǎng)殖得到全面推廣，但傳染病仍是制約其發(fā)展的重大因素。大腸桿菌和腸道沙門菌是典型的人畜共患病原菌，是引起食源性疾病暴發(fā)的常見(jiàn)病原體，嚴(yán)重威脅著世界各國(guó)公共衛(wèi)生安全，同時(shí)也是造成幼畜禽大批死亡，影響其健康生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量的重要細(xì)菌性傳染病病原體[2-4]。因大腸桿菌和沙門菌血清型眾多，針對(duì)性的疫苗研制和防控非常困難，往往采取藥物防治方法，但目前嚴(yán)重的多重耐藥性問(wèn)題給養(yǎng)殖場(chǎng)造成了巨大的防控困難。本試驗(yàn)從暴發(fā)雛鵝急性死亡的朗德鵝養(yǎng)殖場(chǎng)中患有腹瀉、精神萎靡等癥狀的發(fā)病朗德鵝幼雛組織上分離鑒定出1株腸道沙門菌和2株大腸桿菌，并進(jìn)一步對(duì)分離株進(jìn)行了小鼠致病性試驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn)，為獸醫(yī)臨床防控朗德鵝大腸桿菌和沙門菌引起的混合感染提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2019年6月，蘭州市某朗德鵝養(yǎng)殖場(chǎng)9日齡雛鵝大批出現(xiàn)腹瀉、急性死亡等癥狀，3日內(nèi)約40%雛鵝死亡，未死亡雛鵝主要表現(xiàn)為腹瀉、呼吸急促、精神萎靡、不食、扎堆、被毛雜亂。該場(chǎng)將未死亡雛鵝(12日齡)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行剖檢觀察，并采集心臟、肝臟、腎臟等組織進(jìn)行病原分離鑒定。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，營(yíng)養(yǎng)肉湯(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，水解酪蛋白(MH)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，麥康凱培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，藥敏紙片(杭州濱河微生物有限公司)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，EmeraldAmp?MAX PCR Master Mix(寶生物工程(大連)有限公司)，DNA Marker DL2000(寶生物工程(大連)有限公司)，瓊脂糖(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠12只，體重為(20 ± 2)g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 剖檢觀察和細(xì)菌分離純化

對(duì)病雛鵝進(jìn)行剖檢觀察并記錄，采集心臟、肝臟、腎臟等組織樣劃線接種于TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)16～24 h，挑取單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，然后對(duì)純化菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢觀察。

1.5 細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序

取上述純化菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取培養(yǎng)物基因組作為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增分離株 16S rRNA基因[5]，引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為25 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共 35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸 10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并按照DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行切膠回收，送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 16S rRNA基因同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將分離菌的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果提交至NCBI，進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載GenBank中相關(guān)序列，利用MEGA 7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.7 小鼠致病性試驗(yàn)

將純化的分離菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)16～24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD600值并調(diào)整至1，此時(shí)菌液濃度約為1～1.5×108CFU/mL，將12只小鼠隨機(jī)分成4組，每組3只，試驗(yàn)組(Ⅰ～Ⅲ組)腹腔注射3株不同菌液各0.25 mL，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，觀察小鼠臨床癥狀、死亡情況和病理變化并記錄。

1.8 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[6]的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行結(jié)果評(píng)判。從TSA瓊脂培養(yǎng)基中挑取純化培養(yǎng)物3～5個(gè)菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)2～6 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD600值并調(diào)整至1，此時(shí)菌液濃度約為1～1.5×108CFU/mL，采用無(wú)菌棉簽均勻涂布至MH平板上，取藥敏紙片放置在平板上，37 ℃ 培養(yǎng)16～24 h后測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理觀察

剖檢雛鵝可見(jiàn)心包、肝表面、肋骨以及后肢大腿肌肉上均附著大量纖維素性滲出液，心包渾濁，有積液，呈現(xiàn)纖維素性心包炎，膽囊腫大，肝表面覆蓋著一層灰白色纖維素膜狀物。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

分離菌在伊紅美蘭培養(yǎng)基上呈現(xiàn)2種菌落，一種黑色帶金屬光澤，另外一種為透明無(wú)色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分別為粉紅色不透明和無(wú)色半透明菌落；在TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均為半透明灰白色菌落。革蘭染色結(jié)果顯示所有菌株為陰性桿菌，無(wú)芽胞。

2.3 16S rRNA測(cè)序結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將16S rRNA測(cè)序結(jié)果上傳NCBI，經(jīng)BLAST分析后，結(jié)果1株為腸道沙門菌，命名為19129株；2株為大腸桿菌，分別命名為T19130株和T19131株。從基于16S rRNA 序列所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，以3株大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列作為外類群可將進(jìn)化樹(shù)分為3個(gè)組群，其中本次分離19129株與腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種聚為簇2，表明可能為腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種，與豬源腸道沙門菌JQ975904菌株表現(xiàn)出較高的同源性(圖1)。圖2以肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)作為外類群可將進(jìn)化樹(shù)分為2個(gè)組群，其中本次分離株T19130和T19131與大腸桿菌聚為簇1，表明分離株為大腸桿菌。其中T19131與人源菌株CP008697同源性較高，而T19130則表現(xiàn)出與鴨源菌株JX267124具有較高的同源性。

?本試驗(yàn)分離菌株

?本試驗(yàn)分離菌株

2.4 致病性試驗(yàn)

接種細(xì)菌12 h后，菌株19129、T19130和T19131攻毒小鼠皆表現(xiàn)為精神沉郁、蜷縮在一角，目光呆滯，不采食，16 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，1周內(nèi)死亡數(shù)量分別為2、2和1只，死亡率分別為66.7%、66.7%和33.3%。剖檢小鼠，急性死亡小鼠未見(jiàn)明顯病理變化，其余發(fā)病和死亡小鼠心包、肝表面附著有大量纖維素性滲出液，取肝臟和心臟等組織可分離出病原菌。對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常。

2.5 藥敏試驗(yàn)

由表1可知，從雛鵝病變組織上分離出的3株細(xì)菌對(duì)諾氟沙星、阿莫西林、氨芐西林、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素等耐藥；3株分離菌對(duì)呋喃唑酮、復(fù)方新諾明、多黏菌素B敏感；除此之外，T19130和T19131菌株對(duì)美羅培南、大觀霉素藥物敏感。

表1 分離菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

家禽養(yǎng)殖發(fā)展一直以來(lái)就極易受到各種傳染病的制約，其中大腸桿菌和沙門菌是危害養(yǎng)禽業(yè)最主要的細(xì)菌性病原[9]，往往造成大批家禽死亡，或是造成弱雛影響生產(chǎn)效益，而目前難以解決的耐藥性問(wèn)題使得禽大腸桿菌病和沙門菌病難以防控。

禽大腸桿菌病每年都會(huì)給全球養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[10]，其病原為禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicE.coli，APEC)，是人源腸外致病性大腸桿菌毒力基因的潛在貯存宿主。沙門菌中包括雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌以及其他有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的沙門菌是禽沙門菌病的三大病原菌[11]，其中引起禽副傷寒的沙門菌包括腸道沙門菌等能感染其他動(dòng)物并能通過(guò)受感染的產(chǎn)品傳播給人類，引起人沙門菌感染和食物中毒，因此具有重要的公共衛(wèi)生意義[12-14]。本試驗(yàn)從該場(chǎng)患病朗德鵝上分離出1株腸道沙門菌和2株大腸桿菌，接種小鼠出現(xiàn)了明顯的臨床癥狀和死亡，并從發(fā)病或死亡小鼠心臟和肝臟等組織中分離到病原菌，證實(shí)了分離株的毒力，這表明本次鵝場(chǎng)暴發(fā)的致死性雛鵝疫病是由大腸桿菌和腸道沙門菌混合感染所致。另外，通過(guò)對(duì)分離株16S rRNA序列進(jìn)化分析表明，分離株可能存在著感染豬和人的潛在公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。

大腸桿菌和沙門菌混合感染畜禽比較普遍，混合感染加重病情并升高了死亡率，也導(dǎo)致臨床診斷和防治的困難。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知分離菌株存在嚴(yán)重的多重耐藥性問(wèn)題，李琳等[15]報(bào)道了130株雞源大腸桿菌中有90.8%的菌株是多重耐藥菌株；陳春林等[16]對(duì)重慶地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)大腸桿菌、沙門菌的耐藥情況進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)110株大腸桿菌中80.0%為多重耐藥株，8株沙門菌中100%為多重耐藥株。彭峻烽等[17]對(duì)成都鴨屠宰生產(chǎn)污染沙門菌耐藥狀況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)99株沙門菌中多重耐藥率達(dá)47.47%。盡管當(dāng)前防治細(xì)菌性傳染病，抗菌藥物仍然是首選工具之一，但多地報(bào)告的禽源大腸桿菌和沙門菌耐藥情況，已顯示出當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)利用抗菌藥物來(lái)防控禽大腸桿菌病和沙門菌病的狀況十分不樂(lè)觀。實(shí)際上，細(xì)菌可通過(guò)天然克隆與表達(dá)系統(tǒng)，即整合子-基因盒將耐藥基因傳遞或捕獲外源耐藥基因，造成細(xì)菌耐藥性的傳播，食源性途徑是耐藥菌株(包括其耐藥基因)由動(dòng)物到人的主要傳播途徑，這將對(duì)動(dòng)物疾病的防控以及公共衛(wèi)生安全形成潛在威脅[18-20]。

為應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性這樣的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，目前國(guó)家已經(jīng)出臺(tái)了《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃(2017—2020)年》[21]，其目的就是為了有效應(yīng)對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥挑戰(zhàn)，提高獸用抗菌藥物科學(xué)管理水平，保障養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全，保障人民群眾身體健康。從此次朗德鵝大腸桿菌和沙門菌混合感染及病原多重耐藥可以看到，細(xì)菌性傳染病的防治仍任重道遠(yuǎn)，科學(xué)飼養(yǎng)管理、合理用藥以及“減抗”技術(shù)如細(xì)菌疫苗研制仍需繼續(xù)加強(qiáng)。