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    禽腺病毒血清4型纖突蛋白1(Fiber 1)多克隆抗體的制備

    2020-09-27 02:57:04曹潔劉萌陳雨晴閆麗萍
    畜牧與獸醫(yī) 2020年10期
    關鍵詞:效價孵育克隆

    曹潔,劉萌,陳雨晴,閆麗萍

    (教育部動物健康與食品安全國際聯(lián)合試驗室/江蘇省動物免疫工程試驗室/江蘇省陸生野生動物疫源疫病檢測中心/南京農(nóng)業(yè)大學免疫研究所/南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095)

    禽腺病毒(fowl adenovirus,F(xiàn)AdV)是嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要病毒之一,依據(jù)不同的抗原結構可將FAdV分成3個群,其中Ⅰ群FAdV根據(jù)其結構中L1~L4 4個高變環(huán)的特點和限制性內(nèi)切酶片段長度不同可分成5個基因型(A~E),通過血清中和試驗可將其劃為12個血清型(1~7、8a、8b、9~11)[1]。FAdV自1987年在巴基斯坦首次報道[2],隨后蔓延至墨西哥、俄羅斯、日本、韓國、印度、智利、伊拉克、孟加拉國和南美洲等多個國家[3-10]。2012年,韓國Choi等[7]發(fā)現(xiàn)FAdV在雞群中暴發(fā),病原檢測主要為FAdV血清4型(FAdV-4)和血清8型(FAdV-8),此外大部分發(fā)病雞伴隨其他免疫抑制性疾病。2013年,Kajan等[11]報道了匈牙利東部地區(qū)暴發(fā)以FAdV-D和FAdV-E為主,并伴隨FAdV-B感染的FAdV病,發(fā)病雞群的特征癥狀主要表現(xiàn)為沙囊糜爛和包涵體肝炎。2015年Zhao等[12]通過病毒的分離鑒定,從患有包涵體肝炎和心包積液綜合征的病雞組織中檢測出FAdV-C和FAdV-D,這是有關FAdV在中國地區(qū)內(nèi)流行與傳播擴散的首次報道。2015年以來,F(xiàn)AdV-4因其發(fā)病率高且既可水平傳播又可垂直傳播的特點,在中國地區(qū)內(nèi)擴散迅猛并大范圍流行[13]。病雞主要表現(xiàn)為心包淡黃色積液、肝臟腫脹、肺臟水腫并伴有尿酸鹽沉積等癥狀,給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[14]。

    FAdV是二十面體對稱的無囊膜雙鏈DNA病毒,基因組總長度約為45 kb,病毒衣殼主要由3種結構蛋白包括六鄰體蛋白(Hexon)、纖突蛋白(Fiber)和五鄰體蛋白(Penton base)構成。其中Hexon蛋白是含量最高的結構蛋白,能夠有效刺激機體產(chǎn)生中和抗體,與病毒的免疫原性密切相關;Penton base蛋白分布于每個二十面體的頂端,具有類似毒素的活性,可引起宿主細胞的細胞病變現(xiàn)象,在病原體入侵的全過程具有極為重要的功能[15];Fiber蛋白可分為 Fiber 1和Fiber 2,它與病毒中和、細胞受體結合、組織趨向性和毒力的變化有關,F(xiàn)iber 1和Fiber 2蛋白與Penton base相連伸出[16-17]。Fiber的長短不一,可直接調(diào)節(jié)宿主細胞表面具有識別和黏附細胞外基質功能的整聯(lián)蛋白對病毒與細胞相結合的過程,在病原體侵入宿主細胞及與相關特異性蛋白結合等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的調(diào)控功能。目前國內(nèi)研究工作多為針對FAdV的Fiber 2蛋白抗體的制備及檢驗方法的建立,缺乏對Fiber 1相關抗體的研究。因此,本試驗制備了國內(nèi)C型FAdV-4流行毒株的Fiber 1的多克隆抗體,為研發(fā)FAdV-4相關診斷試劑及疫苗提供基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞、質粒及試驗動物

    FAdV-4、原核表達載體pCold I、雞肝癌細胞LMH及大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞均為本實驗室保存;2月齡體重2.5 kg左右的新西蘭大白兔購自南京卡文斯生物技術有限公司。

    1.1.2 主要試劑

    XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase、ClonExpress Ⅱ one step cloning kit均購自諾唯贊生物科技有限公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、多聚賴氨酸均購自Sigma公司;異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗均購自KPL公司;NI-NTA填料購自QIAGEN公司;化學發(fā)光(ECL)顯色液購自Biosharp公司;高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清為Life Technologies公司產(chǎn)品;病毒DNA提取試劑盒購自南京擎科生物有限公司;引物合成以及測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

    1.2 pCold Ⅰ-Fiber 1原核表達載體的構建和表達純化

    收集病毒培養(yǎng)液上清,用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA,作為FAdV-4 Fiber 1基因的擴增模板。從NCBI上下載FAdV-4 Fiber 1基因全長,并用Primers 5.0軟件根據(jù)參考序列(GeneBank登錄號:MF595801)設計特異性引物,F(xiàn):5′-CATATGGAGCTCGGTACCctcgagATGTCGGCCCTAAT-CGCCTCCGCAG-3′(小寫字母為XhoⅠ酶切位點),R:5′-AGACTGCAGGTCGACaagcttTTAGGGGCCCGG-AGCATTGTTC-3′(小寫字母為HindⅢ酶切位點),擴增得到含同源臂的PCR產(chǎn)物全長1 341 bp。用同源重組酶將PCR產(chǎn)物與XhoⅠ和HindⅢ位點雙酶切后的pColdⅠ載體連接,繼而轉化入DH5α感受態(tài)細胞中。涂布于氨芐固體培養(yǎng)基37 ℃ 溫箱過夜培養(yǎng)后,挑選單克隆菌株擴大培養(yǎng)然后采用菌液PCR鑒定和測序分析,得到重組陽性質粒,命名為pCold Ⅰ-Fiber 1。將陽性菌接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中,活化培養(yǎng)約2 h至菌液呈云霧狀,用1 mmol/L IPTG 16 ℃ 過夜誘導或37 ℃ 誘導4 h。然后將培養(yǎng)液12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min,用少量PBS吹打重懸菌體,而后進行超聲破碎,離心取上清和沉淀。用SDS-PAGE檢測目的蛋白在沉淀和上清中的表達情況后,取超聲破碎后的包涵體,加入8 mol/L的尿素使其充分溶解,再按照NI-NTA試劑盒說明書將融合蛋白進行純化,通過SDS-PAGE方法鑒定純化效果,再將高濃度的純化蛋白儲存于-80 ℃冰箱中備用。

    1.3 Fiber 1多克隆抗體的制備

    首次免疫時,將上述已驗證純化效果良好的融合蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合,4 ℃ 環(huán)境中過夜震蕩使蛋白充分混勻乳化,然后對2只新西蘭白兔通過背部皮下多點注射的方式進行第1次免疫(1 mg/只)。初免后每隔2周進行加強免疫,使用相同方式將弗氏不完全佐劑與純化蛋白混勻,充分乳化后進行皮下多點注射(1 mg/只),共加強免疫2次。期間檢測ELISA抗體效價達到105以上,即可心臟采血收集血清,作為一抗置于-80 ℃ 保存?zhèn)溆?,若抗體效價較低可選擇再加強免疫1次。

    1.4 ELISA測定抗體效價

    將純化鑒定好的pCold Ⅰ-Fiber 1蛋白作為包被原,用包被液稀釋至2 μg/mL,100 μL/孔添加至ELISA板中,置于4 ℃ 過夜或37 ℃ 作用2 h。然后用PBST洗滌3次,拍干酶標板后加入5% 脫脂奶37 ℃ 封閉30 min。再用PBST溶液洗3次,將待檢驗的兔血清與陰性兔血清分別10倍倍比稀釋加入ELISA板中,100 μL/孔,37 ℃ 孵育1 h后用PBST洗滌3次并拍干,用5% 脫脂奶溶液1∶5 000倍稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-YKT)并加至ELISA板中,37 ℃作用45 min。孵育結束后洗滌3次并拍干,避光加入顯色液,100 μL/孔,充分反應約10 min后,每孔加入50 μL終止液終止顯色。將終止顯色的ELISA板放入多功能酶標儀,測量OD450。P作為待檢樣品值,N作為陰性對照值,當P/N>2.1時待檢樣品被判定為陽性,否則為陰性。

    1.5 Western blot鑒定多抗反應性

    將FAdV-4以感染復數(shù)(MOI)為0.01接種于LMH細胞中,接毒36 h后收集細胞樣品;同時取pCold Ⅰ與pCold Ⅰ-Fiber 1超聲破碎前全菌以及破碎后的上清和沉淀菌液加入適量4×的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液煮沸10 min。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠,按順序加樣(上樣前樣品需1 200 r/min 離心5 min)用80 V電壓電泳40 min,再調(diào)至120 V電壓電泳1 h。然后用半干轉法將膠轉印到硝酸纖維膜素上,轉印完成后5%脫脂奶常溫封閉1 h,PBST常溫振蕩洗滌3~5次,每次5 min。然后使用1∶1 000倍稀釋的兔抗Fiber 1 的多克隆抗體作為一抗4 ℃ 搖床過夜孵育膜,5%脫脂奶1∶15 000倍稀釋HRP-YKT作為二抗 37 ℃ 孵育1 h,PBS洗滌3~5次,每次5 min,后用ECL顯色觀察結果。

    1.6 間接免疫熒光檢測多克隆抗體特異性

    將LMH細胞平鋪于多聚賴氨酸處理后的96孔培養(yǎng)板上,使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞量約占培養(yǎng)皿的80%時,用無菌PBS洗滌細胞3次。再用無血清培養(yǎng)基將FAdV-4分離株稀釋至每孔接毒量為MOI = 0.01,37 ℃ 吸附1.5 h后,棄掉培養(yǎng)液并用2%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基代替,隨后置于37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。觀察到感染細胞回縮變圓,發(fā)生明顯且典型的細胞病變并脫落時,用4%多聚甲醛溶液常溫固定細胞15 min;PBS洗滌3次,然后加Fiber 1兔多抗血清或兔陰性血清,用5%脫脂奶按不同稀釋倍數(shù)進行稀釋,37 ℃ 孵育1.5 h;PBS洗滌3次,加400倍稀釋FITC 標記的羊抗兔 IgG,37 ℃ 孵育45 min;PBS洗3次后,每孔加入50 μL PBS溶液,置熒光顯微鏡下觀察結果(注意孵育二抗及顯色過程需避光)。

    2 結果與分析

    2.1 FAdV-4 Fiber 1 基因的擴增

    收集接毒的LMH細胞,提取基因組,用設計的帶有同源臂的引物進行Fiber 1基因全長的擴增。如圖1所示,擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在1 341 bp處有單一的擴增條帶。帶有同源臂的PCR產(chǎn)物與XhoⅠ和HindⅢ雙酶切的pCold Ⅰ載體通過同源重組酶連接后,轉化入DH5α感受態(tài)細胞中,挑取單克隆菌株送公司測序,通過Megalign軟件比對測序結果,確定pCold Ⅰ-Fiber 1重組載體構建成功。

    M.DL2000 DNA Maker;1.Fiber 1基因;2.陰性對照

    2.2 融合蛋白在Rosetta感受態(tài)細胞中的誘導表達及純化

    SDS-PAGE結果表明無論在16 ℃過夜還是37 ℃ 4 h誘導表達條件下,F(xiàn)iber 1融合蛋白均以包涵體的形式存在,分子質量約53 kDa,與預期大小一致(圖2)。采用鎳柱純化重組蛋白,SDS-PAGE結果顯示純化的蛋白條帶單一,純化效果良好(圖3)。各管測定蛋白濃度后,取高于0.5 mg/mL的蛋白進行后續(xù)的乳化免疫程序。

    M.蛋白Marker;1、7.pCold Ⅰ誘導前;2、8.pCold Ⅰ誘導后;3、9.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導前;4、10.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導后全菌;5、11.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導上清;6、12.pCold Ⅰ-Fiber 1誘導沉淀

    M.蛋白Marker;1~5.16 ℃過夜誘導后表達蛋白純化的洗脫液;6~10.37 ℃ 4 h誘導表達蛋白純化的洗脫液

    2.3 ELISA檢測二免、三免后血清抗體水平

    第2次免疫1周內(nèi)和第3次免疫1周內(nèi),分別通過兔耳緣靜脈采血方法收集兔血4 mL并分離血清。ELISA檢測血清抗體效價,如表1所示,二免后血清抗體效價達到104,故選擇繼續(xù)免疫1次,三免后測得抗體效價達到105以上,心臟采血收集陽性血清。

    表1 ELISA檢測二免、三免后血清抗體效價水平

    2.4 Western blot驗證多克隆抗體的反應性

    用FAdV-4感染LMH細胞,3 d后細胞產(chǎn)生明顯病變時收樣,與誘導、未誘導的pCold Ⅰ空載以及重組蛋白pCold Ⅰ-Fiber 1全菌進行Western blot,驗證多克隆抗體的特異性。如圖4所示,在約53 kDa處Fiber 1多克隆抗體能夠與Fiber 1蛋白以及全病毒感染的細胞產(chǎn)生明顯的反應,而相同位置的空載對照組無明顯條帶,說明試驗所得的Fiber 1多克隆抗體特異性良好。

    M.蛋白Marker;1.pCold Ⅰ空載體對照;2.pCold Ⅰ-Fiber 1蛋白;3.未感染的LMH細胞;4.FAdV-4感染LMH細胞

    2.5 間接免疫熒光鑒定多克隆抗體

    FAdV-4感染LMH細胞,用4%多聚甲醛固定細胞板,將Fiber 1多抗血清以及陰性血清按不同比例進行稀釋,37 ℃ 孵育1.5 h后,F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG(1∶400倍)二抗37 ℃避光孵育45 min,而后在熒光顯微鏡下觀察。如圖5所示,陰性血清1∶200稀釋時無非特異性背景,陰性對照成立,F(xiàn)iber 1多抗陽性血清稀釋至1∶3 000時仍可觀測到熒光,且特異性良好。

    A.一抗1∶200;B.一抗1∶1 500;C.一抗1∶3 000;D.陰性對照1∶200

    3 討論

    FAdV-4自2015年在中國暴發(fā)以來,迅速擴散至新疆、湖北、河南、山東、黑龍江、江蘇、陜西等各個地區(qū)[18]。在2015年至2016年在中國各地區(qū)顯示包涵體肝炎(IBH)和心包積液綜合征(HPS)家禽中分離到105株FAdV,F(xiàn)AdV-4感染率高達93%,其中64.8%為FAdV-4單獨感染,表明FAdV-4是中國目前造成不同品種雞高死亡率的優(yōu)勢血清型[19]。Pan等[20]通過序列比對發(fā)現(xiàn),中國分離到的高致病性FAdV-4基因組區(qū)域與非致病性毒株相比,存在獨特的1 966 bp核苷酸缺失,并在Fiber 1、Fiber 2、Penton和Hexon上也發(fā)現(xiàn)多種不同的氨基酸取代。因此,對病毒主要結構蛋白進行深入研究,對了解FAdV-4的流行情況和致病機制具有重要意義。

    國內(nèi)外有關FAdV-4致病機制研究和病原檢測以及抗體的制備主要針對Hexon與Fiber 2蛋白。有文獻構建和拯救一系列致病或非致病的FAdV-4的嵌合病毒,結果表明Fiber 2與Hexon蛋白可能與病毒毒力密切相關[21]。Steer等[22]通過檢測FAdV-Hexon基因P1和L1區(qū)域的差異,從而對不同種FAdV進行檢測,可精確區(qū)分12種FAdV血清型。與此同時,F(xiàn)iber 2蛋白在原核表達系統(tǒng)中成功表達并純化,以重組蛋白為基礎的間接ELISA等檢測方法也成功建立[23]。但目前有關Fiber 1感染病毒的具體作用機制研究較少,相關的快速血清學診斷方法尚未開發(fā)。

    本研究通過同源重組方法成功構建了pCold Ⅰ-Fiber 1原核表達載體,證實在37和16 ℃條件下Fiber1蛋白均可高效表達在包涵體中。免疫純化蛋白后的兔血清,ELISA效價達1∶100 000,Western blot檢驗結果顯示該血清抗體既能夠識別重組載體pCold Ⅰ-Fiber 1中的Fiber 1 蛋白也可識別FAdV-4全病毒中的Fiber 1蛋白,但原核表達Fiber 1蛋白的大小比全病毒的略大,分析其原因是在Fiber 1的ATG起始密碼子前面第69位核苷酸處,pCold Ⅰ載體自身有蛋白表達的起始密碼子,所以與FAdV-4病毒中的Fiber 1大小略有不同。為進一步驗證Fiber 1多克隆抗體的可靠性,間接免疫熒光檢測了FAdV-4全病毒與Fiber 1多克隆抗體的反應,結果發(fā)現(xiàn)兔多抗血清稀釋3 000倍后依然具有較高的活性,證明制備所得的多克隆抗體反應性與特異性良好。本研究制備的Fiber 1多克隆抗體可為進一步研究FAdV的主要結構蛋白在病毒感染過程中發(fā)揮的作用機制提供物質基礎。

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