不同劑量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)蛋雞肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

尚月麗，陳菊紅，楊俊花，趙志輝

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)屬單端孢霉烯族化合物，是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，是世界上分布最廣泛的真菌毒素之一。DON可以通過(guò)污染的小麥、燕麥和玉米等原料進(jìn)入食品和飼料中[1-2]。DON性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐壓、耐弱酸、耐儲(chǔ)藏，一般的加工過(guò)程都不會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，降低毒性。因此，DON極易通過(guò)食物鏈對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生急性、慢性、細(xì)胞、免疫等多種毒性作用，危害動(dòng)物健康，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

近年來(lái)，不同的研究指出DON可引起肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、腸道和腦組織的損傷，其中肝臟是主要的靶器官。Kubena等(1987)報(bào)道從1日齡到產(chǎn)蛋期，蛋雞飼料中DON含量為18 mg/kg，從開(kāi)始產(chǎn)蛋持續(xù)觀察6個(gè)周期，每個(gè)周期28 d，未發(fā)現(xiàn)肝臟組織有明顯的病理學(xué)變化。日糧中添加DON(1和5 mg/kg飼料含量)不影響肉雞肝臟的重量[3]。肉雞分別飼喂3.4、8.2和10 mg/kg 飼料的DON含量不影響肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化酶[4-5]。然而，Moon等[6]在雞胚內(nèi)注射2g/g蛋重的DON，24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雞胚肝臟內(nèi)出現(xiàn)脂肪化空泡，48 h后肝臟空泡化壞死進(jìn)一步增加；出生后進(jìn)行二次口服DON暴露，發(fā)現(xiàn)48 h后脂滴積聚顯著增加。Tiemann等[7-8]報(bào)道，分別對(duì)發(fā)情期母豬和妊娠期的母豬飼喂含DON和玉米赤霉烯酮的飼料，能引起肝細(xì)胞的空泡化壞死。飼喂黃曲霉毒素和DON聯(lián)合污染的飼料則會(huì)增加肝組織的纖維化[9]。然而，Pollmann等(1985)發(fā)現(xiàn)DON不會(huì)對(duì)豬肝臟產(chǎn)生顯著影響。小鼠上的研究表明，每千克體重25 μg DON能夠引起小鼠肝臟小葉間靜脈周圍組織壞死，中央靜脈周圍單核細(xì)胞浸潤(rùn)[10]。但也有報(bào)道顯示，71～355 μg/kg DON飼喂小鼠，不會(huì)引起肝臟重量的改變[11]。此外，不同動(dòng)物對(duì)DON的敏感程度存在一定的差異，其中豬最為敏感，家禽與嚙齒類、犬和貓相比敏感性較差，但是家禽比反芻動(dòng)物敏感，這可能與反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的微生物代謝DON有關(guān)[12-13]。以上研究發(fā)現(xiàn)，即使比較敏感的動(dòng)物，報(bào)道結(jié)果也不一致，在禽上報(bào)道的結(jié)果也不一致，DON能否對(duì)蛋雞肝臟組織產(chǎn)生損傷有待進(jìn)一步研究。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞產(chǎn)蛋期間灌服DON，1 mg/kg組血清肝臟堿性磷酸酶(ALP)活性顯著增加；當(dāng)DON灌服劑量達(dá)10 mg/kg時(shí)產(chǎn)蛋量明顯下降，顯著降低血清中ALP活性、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性[14]。然而，DON對(duì)蛋雞肝臟功能的影響是否伴隨肝臟組織病理學(xué)的改變，有待進(jìn)一步研究。

本研究旨在觀察不同劑量DON對(duì)蛋雞肝臟指數(shù)及組織形態(tài)學(xué)的影響，為探索DON對(duì)肝臟損傷的影響提供組織病理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DON標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%(新加坡公司Pribolab)，購(gòu)自北京普華仁生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。使用前用無(wú)菌生理鹽水稀釋。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

隨機(jī)選擇體況良好，體重(1.90 ± 0.2)kg和產(chǎn)蛋率基本一致的26周齡海蘭蛋雞120只，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只雞，預(yù)飼期1周。所有雞采用灌胃方式，對(duì)照組灌胃 0.2 ml 等量的生理鹽水，其他各試驗(yàn)組，分別按體重灌胃1、5、10、20、50 mg/kg DON。試驗(yàn)期間每天灌服1次，連續(xù)灌服6周。試驗(yàn)雞按封閉式蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)管理，采用2層階梯式籠養(yǎng)，每天保證充足光照16 h，室溫16～20 ℃，濕度50%～60%，蛋雞自由采食、飲水，每日7:00投喂1次。蛋雞飼喂基礎(chǔ)日糧參考文獻(xiàn)[14]。

1.3 樣品采集及檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只雞，稱重，脫頸致死，后打開(kāi)腹腔，將肝臟分離出，并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)(%)= 肝臟重量(g)/體重(g)100%。

在不同處理組肝臟同一部位采集樣品，迅速置于10%福爾馬林溶液中固定24 h。常規(guī)脫水、透明、透蠟和包埋，制作石蠟切片，切片厚5 μm，采用HE常規(guī)方法進(jìn)行染色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON對(duì)蛋雞肝臟指數(shù)的影響

表1顯示，當(dāng)攝入DON達(dá)到10 mg/kg時(shí)，肝臟指數(shù)較對(duì)照組極顯著增加(P<0.01)。當(dāng)攝入DON量升高到20 mg/kg時(shí)，肝臟指數(shù)開(kāi)始減少，但是與對(duì)照組和其他劑量組(1、5、50 mg/kg)比較并沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。當(dāng)攝入的劑量增加到50 mg/kg時(shí)，肝臟指數(shù)與對(duì)照組和其他劑量組(1、5、10 mg/kg)相比均顯著下降(P<0.05)。

表1 不同劑量DON對(duì)蛋雞肝臟指數(shù)的影響 %

2.2 DON對(duì)肝臟結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組(圖1A)中肝索排列整齊規(guī)律，中央靜脈結(jié)構(gòu)完整。1 mg/kg DON組(圖1B)，小葉間靜脈周圍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，在炎癥細(xì)胞與肝組織交界處，肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重。5 mg/kg DON組(圖1C)，中央靜脈管腔擴(kuò)大，周圍出現(xiàn)了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)壞死灶。10 mg/kg DON組(圖1D)，匯管區(qū)出現(xiàn)了大量的炎癥細(xì)胞，血管擴(kuò)張，內(nèi)充盈大量紅細(xì)胞，血管壁結(jié)構(gòu)不清楚。20 mg/kg DON組(圖1E)，肝血竇腔增大內(nèi)出現(xiàn)淤血，在匯管區(qū)可見(jiàn)小葉間膽管，在小葉間靜脈周圍出現(xiàn)局灶性溶解性壞死。50 mg/kg組(圖1F)，匯管周圍肝實(shí)質(zhì)現(xiàn)大量的局灶性溶解性壞死，并有空洞現(xiàn)象出現(xiàn)，壞死區(qū)外周發(fā)生纖維化。

A.對(duì)照組；B.1 mg/kg組，粗箭頭顯示肝小葉間靜脈中充滿血液，細(xì)箭頭顯示肝小葉1區(qū)肝細(xì)胞空泡化變性；C.5 mg/kg組，粗箭頭顯示中央靜脈靜脈管腔增大，細(xì)箭頭顯示中央靜脈周圍形成炎癥壞死灶；D.10 mg/kg組，細(xì)箭頭顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，粗箭頭顯示小葉間靜脈血管充血；E.20 mg/kg組，細(xì)箭頭顯示肝血竇淤血，竇腔增大，粗箭頭顯示局灶性溶解性壞死；F.50 mg/kg組，細(xì)箭頭顯示局灶性溶解性壞死區(qū)，粗箭頭顯示溶解空洞，三角形顯示纖維化

3 討論

DON作為谷物中檢出率和檢出量最高的霉菌毒素，對(duì)人類和動(dòng)物的健康均構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[15]。肝臟是主要的功能器官，可進(jìn)行膽紅素、膽汁酸、碳水化合物、脂質(zhì)以及藥物、殺蟲(chóng)劑和致癌物質(zhì)等有毒副作用物質(zhì)的代謝，也是蛋白的合成和執(zhí)行免疫功能的主要器官[16]。Prelusky等(1986)給白來(lái)航雞灌胃放射標(biāo)記的DON，小于1%劑量在腸道內(nèi)被吸收，不過(guò)在腎臟、肝臟、脾臟組織分布最高，表明肝臟是DON毒性作用的靶器官。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1和5 mg/kg DON不影響肝臟指數(shù)，這一發(fā)現(xiàn)與Wickramasuriya等[17]飼喂0、0.25、0.5、0.75和1.0 mg/kg DON污染的飼料沒(méi)有對(duì)蛋雞肝臟指數(shù)產(chǎn)生影響的結(jié)果一致，與Awad等[3]研究肉雞飼料中1或5 mg/kg DON不影響肝臟指數(shù)的報(bào)道類似。同樣，Morrissey等(1985)給大鼠飼喂含20 mg/kg DON的飼料也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)肝臟指數(shù)產(chǎn)生影響。與Lee等[18]報(bào)道飼料中等含量的黃曲霉毒素(1.5 mg/kg)與DON(1.5 mg/kg)混合和高劑量的黃曲霉毒素(2.0 mg/kg)與DON(2.0 mg/kg)均能夠增加產(chǎn)蛋雞肝臟重量類似。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10 mg/kg DON引起產(chǎn)蛋雞肝臟指數(shù)增加，與Bergsjo等(1993)報(bào)道豬飼料中3.5 mg/kg DON引起豬肝重增加的結(jié)果一致。隨著產(chǎn)蛋雞攝入DON的劑量進(jìn)一步增加到50 mg/kg，產(chǎn)蛋雞肝臟指數(shù)較對(duì)照組顯著降低，與肉雞飼料中5 mg/kg 的DON降低肝臟重量結(jié)果一致[19]，與火雞上自然污染3種真菌毒素(含DON)檢測(cè)到火雞肝臟重降低[20]的研究報(bào)道也類似。豬飼料中含6 mg/kg DON也同樣檢測(cè)到肝臟重量降低[21]。給豬飼喂天然污染DON的飼料，也能夠檢測(cè)到肝臟重量降低[22]。Forsell等(1986)報(bào)道小鼠飼料中DON含量為10和20 mg/kg也同樣能夠檢測(cè)到小鼠肝臟重量降低。以上不同物種得到了類似的結(jié)果，低劑量可能不影響肝臟重量，中劑量可能引起肝臟重量升高，高劑量或者更高劑量可以引起肝臟重量降低。本試驗(yàn)顯示，隨著每日攝入DON的劑量增加，肝臟指數(shù)升高，隨著DON攝入量的進(jìn)一步升高，肝臟指數(shù)又開(kāi)始下降，顯示DON對(duì)肝臟指數(shù)的影響呈劑量依賴性。自然污染飼料中是真菌毒素的混合物，與單一毒素引起肝臟變化可能存在劑量上的不一致。

肝臟作為重要的功能器官，是不同外源性有毒有害物質(zhì)的重要靶組織，也是毒性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。正常的肝臟形態(tài)學(xué)：肝小葉呈六邊形是肝臟結(jié)構(gòu)和功能的最小單位，肝小葉的中間形成中央靜脈，肝小葉六邊形角處形成匯管區(qū)，由門(mén)靜脈、膽管、肝動(dòng)脈、神經(jīng)、淋巴管組成，垂直匯管區(qū)肝門(mén)靜脈分出小葉間靜脈，進(jìn)入肝小葉內(nèi)[23]。不連續(xù)的肝細(xì)胞構(gòu)成匯管區(qū)的外部界限，被稱為限制板。血液從匯管區(qū)分出小葉靜脈和小葉動(dòng)脈進(jìn)入小葉內(nèi)，經(jīng)過(guò)肝血竇最后匯入中央靜脈，緊鄰匯管區(qū)小葉間動(dòng)脈和小葉間靜脈分枝處的肝小葉為1區(qū)，中央靜脈周圍的肝實(shí)質(zhì)為3區(qū)，位于1區(qū)和3區(qū)中間的為肝小葉2區(qū)，1區(qū)肝細(xì)胞氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，2區(qū)、3區(qū)次之[16,23]。區(qū)域結(jié)構(gòu)的識(shí)別在肝臟組織病理和毒理學(xué)評(píng)價(jià)中起到很重要的作用[24]。

本研究中，1 mg/kg的DON靠近小葉間靜脈1區(qū)可觀察到肝細(xì)胞空泡化變性，與給婆羅門(mén)雞飼喂含DON等多種真菌毒素混合污染的飼料引起雞肝臟細(xì)胞發(fā)生空泡化變性相類似[25]；同樣給豬飼喂含DON的飼料，也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)生空泡化變性[26-27]。在本試驗(yàn)中，小葉間靜脈周圍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與小鼠每日灌胃2.5和25 μg/kg 的DON出現(xiàn)匯管區(qū)單核細(xì)胞浸潤(rùn)的報(bào)道結(jié)果一致[10]。通常，肝臟細(xì)胞的空泡性變性是由胞漿內(nèi)的脂滴沉積形成[7]。Hamilton等(1985)報(bào)道給白來(lái)航蛋雞飼喂DON污染的飼料，雞肝臟總脂和甘油三酯含量升高，為組織學(xué)觀察到脂滴的形成提供了重要依據(jù)。

該試驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mg/kg能引起血液中ALP升高[14]。目前組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，小葉間靜脈周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和1區(qū)肝細(xì)胞的空泡化，從組織形態(tài)上印證了DON對(duì)肝細(xì)胞的損傷，可能是受損的肝細(xì)胞釋放出ALP，引起血液中ALP升高。

此外，當(dāng)DON劑量達(dá)到10 mg/kg時(shí)，匯管區(qū)出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張膨脹，同時(shí)檢測(cè)到肝臟指數(shù)升高。當(dāng)DON劑量增加20 mg/kg，匯管周圍可看到局灶性溶解性壞死，此時(shí)肝臟指數(shù)較10 mg/kg組降低，但與對(duì)照組沒(méi)有差異。隨著劑量進(jìn)一步高到50 mg/kg，匯管區(qū)周圍(肝小葉1區(qū))呈現(xiàn)大量局灶性溶解性壞死，可見(jiàn)溶解空洞，同時(shí)伴隨肝臟指數(shù)下降。Tiemann等[7-8]電鏡檢查發(fā)現(xiàn)飼料中DON能夠引起發(fā)情母豬和妊娠母豬的肝細(xì)胞內(nèi)積聚大量的自噬體，也許大量自噬體的出現(xiàn)導(dǎo)致大量肝細(xì)胞死亡，被炎癥細(xì)胞所吞噬，形成局灶性溶解性空洞。本研究發(fā)現(xiàn)DON劑量依賴性引起肝臟的漸進(jìn)性損傷，觀察到局灶性溶解性壞死后肝臟形成空洞，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上，通過(guò)給產(chǎn)蛋期蛋雞每日口服不同劑量的DON發(fā)現(xiàn)，1、5、10、20、50 mg/kg的DON均對(duì)肝臟產(chǎn)生不同程度的病理性影響，并且隨著劑量的增加，肝臟病理性變化呈現(xiàn)漸進(jìn)式損傷增加。10 mg/kg DON增加肝臟指數(shù)，伴隨小葉間靜脈充血，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；當(dāng)DON增加到50 mg/kg時(shí)，肝臟指數(shù)降低，肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量的局灶性溶解性壞死和空洞。研究表明，產(chǎn)蛋雞日糧中DON以劑量依賴性對(duì)肝臟產(chǎn)生漸進(jìn)性肝組織損傷。