高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性及分子機(jī)制

常夢(mèng)圓 孫文靜 徐新軍 付曉艷

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000

糖尿病是以血糖升高為主要癥狀的慢性病，患病人數(shù)逐年增加，長(zhǎng)期慢性高血糖可造成毛細(xì)血管基底膜增厚，使管腔狹窄，加上糖尿病患者脂代謝紊亂，造成血液黏稠度升高，血流緩慢，可致腦血流量減少而引發(fā)一系列問(wèn)題。近年來(lái)，糖尿病對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響已引起人們的廣泛重視，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病人更容易發(fā)生腦卒中[1]，長(zhǎng)期高糖可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，進(jìn)而引起認(rèn)知、學(xué)習(xí)等能力減退，發(fā)展為糖尿病腦病[2]，即糖尿病引起的認(rèn)知障礙和大腦的神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變[3-4]。高濃度葡萄糖介導(dǎo)的神經(jīng)毒性嚴(yán)重限制了其臨床治療效果。因此，探討高糖介導(dǎo)的神經(jīng)毒性及可能的分子機(jī)制對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的預(yù)防及治療具有重要的研究意義和臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 材料

PC12大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；MTT和PI購(gòu)自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)探針 (JC-1) 均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；所有抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)PC12細(xì)胞，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物處理及細(xì)胞活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行高糖毒性檢測(cè)。分別以100、200、400、600和800 mM 5個(gè)濃度的葡萄糖處理PC12細(xì)胞48 h，隨后加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，作用6 h后棄掉上清，每孔加入150 μL的DMSO，輕微震蕩20 min后570 nm處讀取光吸收值。以正常細(xì)胞活性的百分比來(lái)反映細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞活性(%)=(藥物處理組光吸收值/正常對(duì)照組光吸收值)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，胰酶消化、離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，棄掉多余的培養(yǎng)基。用預(yù)冷的75%的酒精固定細(xì)胞過(guò)夜，次日離心棄掉酒精，PBS洗2次，加入PI染液，于37℃避光染色40 min；細(xì)胞過(guò)濾后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布，以Sub-G1峰間接定量細(xì)胞凋亡比例。

1.2.4線粒體膜電位檢測(cè) 將6×105個(gè)PC12細(xì)胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿中；細(xì)胞分別經(jīng)200、400、600 mM葡萄糖處理48 h后，加入終濃度10 μM的JC-1探針?lè)跤?0 min；PBS洗2次，熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的變化。以紅色熒光向綠色熒光的轉(zhuǎn)變反應(yīng)線粒體膜電位的耗散。

1.2.5Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 將8×105個(gè)PC12細(xì)胞接種至9 cm的培養(yǎng)皿；細(xì)胞分別經(jīng)200、400、600 mM葡萄糖處理48 h后，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，離心收集；RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA試劑盒蛋白定量；總蛋白40 μg/孔上樣，SDS-PAGE電泳，濃縮膠70 V，40 min；分離膠110 V，1.5 h；轉(zhuǎn)膜，110 V，75 min；5%脫脂奶粉室溫固定2 h；兔源一抗以1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；次日，TBST洗3次，每次5 min；孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG (1∶2 000)，室溫2 h；TBST洗3次，每次5 min；ECL增強(qiáng)型發(fā)光液顯色，Bio-Rad成像系統(tǒng)成像；β-actin作為陽(yáng)性?xún)?nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 高濃度葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

首先篩選了不同劑量葡糖糖對(duì)PC12細(xì)胞的毒性。如圖1所示，PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度葡萄糖處理48 h后，劑量依賴(lài)性地抑制了PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為細(xì)胞活性的下降。如600 mM 和800 mM葡萄糖處理48 h，細(xì)胞活性分別降低到64.4%和52.9%，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高濃度的葡萄糖表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的細(xì)胞毒性。

與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖1 葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞成活率的影響

2.2 高濃度葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

為檢測(cè)PC12細(xì)胞死亡的機(jī)制，細(xì)胞分別經(jīng)200、400、600 mM葡萄糖處理48 h后，用PI染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。凋亡的細(xì)胞將會(huì)發(fā)生DNA的斷裂，出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，故本實(shí)驗(yàn)以亞二倍體峰 (Sub-G1)來(lái)反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，200 mM葡萄糖處理僅誘導(dǎo)了輕微的細(xì)胞凋亡，凋亡比例為6.3%；400 mM葡萄糖處理誘導(dǎo)了明顯的細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為Sub-G1峰的顯著升高，凋亡細(xì)胞的比例上升到36.3%(P<0.01)；而600 mM葡萄糖處理組凋亡比例進(jìn)一步升高，達(dá)到51.2%(P<0.01)。細(xì)胞凋亡比例的升高伴隨G0/G1期和G2/M期的升高，S期的降低(表1)。以上結(jié)果表明：高糖抑制PC12細(xì)胞生長(zhǎng)主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

表1 葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

2.3 高濃度葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

為進(jìn)一步探討高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制，我們采用JC-1探針來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。如圖3所示，隨著葡萄糖濃度的增高，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，提示葡萄糖劑量依賴(lài)性地降低了PC12細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果表明：高濃度葡萄糖通過(guò)啟動(dòng)線粒體膜電位耗散啟動(dòng)了PC12細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡。

紅色代表線粒體基質(zhì)熒光，綠色代表細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)熒光；紅色熒光向綠色熒光的轉(zhuǎn)變代表線粒體膜電位的降低。圖3 葡萄糖對(duì)PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.4 高濃度葡萄糖對(duì)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)用Western blotting方法檢測(cè)了活性Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)。Caspase-3的活化可直接啟動(dòng)凋亡程序，Caspase-9作為線粒體凋亡的啟動(dòng)者，在啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡中起著至關(guān)重要的作用。結(jié)果如圖4所示，葡萄糖濃度依賴(lài)性地增強(qiáng)了活性Caspase-3和活性Caspase-9的表達(dá)，進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了葡萄糖啟動(dòng)了PC12細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡。

圖4 葡萄糖對(duì)活性Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響

3 討 論

糖尿病是一種以血糖升高為主要特征的代謝障礙綜合征，流行病學(xué)顯示其發(fā)病率呈顯著升高的趨勢(shì)。證據(jù)表明，糖尿病對(duì)神經(jīng)的損傷[5-6]、認(rèn)知功能的影響與持續(xù)的高血糖水平有密切關(guān)系[7]。糖尿病患者持續(xù)高血糖介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，嚴(yán)重限制了其臨床治療效果，影響了患者的生命健康和生活質(zhì)量[8]。因此，深入研究高糖介導(dǎo)的神經(jīng)毒性及可能的分子機(jī)制，有助于理解其在腦老化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變中的作用，對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的預(yù)防及治療具有重要的研究意義和臨床價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，葡萄糖劑量依賴(lài)性的抑制了PC12細(xì)胞生長(zhǎng)，主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)為Sub-G1峰的升高。線粒體膜電位在調(diào)控線粒體凋亡通路方面起到至關(guān)重要的作用[9]。線粒體膜電位的降低是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期事件，往往早于線粒體內(nèi)凋亡因子的釋放[10]。線粒體膜電位的降低，進(jìn)而會(huì)促進(jìn)線粒體內(nèi)部因子的釋放，如活性氧自由基、凋亡誘導(dǎo)因子、細(xì)胞色素C等[11]。本研究中，高濃度葡萄糖的處理有效誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞線粒體膜電位的降低，這是高糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，提示葡萄糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。Caspase是一類(lèi)水解酶，其激活后可傳遞凋亡信號(hào)。Caspase-3是凋亡的執(zhí)行者，可匯集死亡受體和線粒體信號(hào)，最終引起細(xì)胞凋亡[12]。本研究中，Western blotting從蛋白水平檢測(cè)到Caspase-3的激活，進(jìn)一步證實(shí)葡萄糖誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比，高濃度葡萄糖有效地誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的激活，表明高濃度葡萄糖誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡?？傊?，高糖可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制PC12細(xì)胞生長(zhǎng)，預(yù)示著潛在的神經(jīng)毒性，提示抑制高糖介導(dǎo)的神經(jīng)毒性可能是治療糖尿病腦病的新策略。