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      魯中肉羊GLIS1基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

      2020-09-27 03:04:14張壯彪潘林香王金文賀小云儲明星
      家畜生態(tài)學報 2020年9期
      關(guān)鍵詞:魯中產(chǎn)羔糖基化

      張壯彪,潘林香,王金文,賀小云,儲明星*

      (1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室, 北京100193;2. 萊蕪市嬴泰有機農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司, 山東 萊蕪271114;3. 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所, 山東 濟南 250100)

      綿羊(Ovisaries)的產(chǎn)羔數(shù)是一個極其復雜的繁殖性狀,受到多種因素影響,其中遺傳因素占大部分。研究表明多種基因參與綿羊的繁殖調(diào)控。1982年,F(xiàn)ecB基因在Booroola羊中首先被發(fā)現(xiàn)[1],之后其被定位到綿羊6號染色體[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn)該基因(突變)的產(chǎn)生是由于BMPRIB基因的746位堿基突變(A746G)[3-4],該突變導致谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?,進而導致相應蛋白功能改變。對FecB基因進行排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn):攜帶一個拷貝的FecB突變可以增加排卵數(shù)1.5個,產(chǎn)羔數(shù)1個;兩個拷貝數(shù)FecB突變可以顯著增加排卵數(shù)3個,產(chǎn)羔數(shù)1.5個[5]。除此之外,GDF9[6]、BMP15等[7]候選基因也可以影響綿羊的繁殖力。其中BMP15可以調(diào)控GDF9基因的表達進而調(diào)控卵泡發(fā)育[8],也有研究發(fā)現(xiàn)BMPRIB可以編碼BMP15基因的受體,進一步調(diào)控綿羊的繁殖過程[9]。雖然對綿羊的繁殖力研究已經(jīng)持續(xù)數(shù)年,但綿羊產(chǎn)羔數(shù)或繁殖力的差異是如何產(chǎn)生的仍然有待探究。因此探究發(fā)現(xiàn)其他可以影響綿羊繁殖力的候選基因?qū)⒂兄陉U明綿羊高繁殖力的分子機理。

      Gli-similar-1(GLIS1)是由Kim等[10]在2002年克隆出的Krüppel類似蛋白基因,該基因編碼一種富含84.3-kDa脯氨酸的蛋白質(zhì),其主要分布在細胞核內(nèi),且鋅指結(jié)構(gòu)在其核定位中發(fā)揮重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn),該基因在體細胞重編程以及胚胎發(fā)育和基因表達過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。在小鼠受精卵和卵母細胞中該基因也呈高表達[13],且前期通過重測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)GLIS1基因的突變位點與綿羊的繁殖性狀相關(guān)[14],暗示該基因?qū)Ψ敝尺^程具有重要調(diào)控作用,但關(guān)于該基因?qū)d羊繁殖的影響鮮有報道。魯中肉羊作為近年來培育的優(yōu)良肉羊新類群,具有高繁殖力、耐粗飼、抗病力強、適合圈養(yǎng)等特點[15]。探究GLIS1基因多態(tài)性對魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的影響,將有助于該類群的選育,進一步提高經(jīng)濟效益。

      1 材料與方法

      1.1 樣品采集

      384只魯中肉羊血液樣品(綿羊頸靜脈采血)來自萊蕪市嬴泰有機農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司,采集后的樣品用5%檸檬酸鈉抗凝處理,-20 ℃保存。

      1.2 綿羊血液DNA提取

      使用血液基因組提取試劑盒(天根生物科技有限公司,北京)對384只魯中肉羊進行血液DNA的提取,對提取后的血液樣品進行濃度(Nano Drop 2000)和質(zhì)量(1.5%瓊脂糖凝膠電泳)的評估,合格的DNA樣品用于后續(xù)分析。

      1.3 基因分型

      MassARRAY Assay Design v. 3.1軟件用于設計檢測g.27775611T>C位點的單堿基延伸引物(登錄號:NC_019458.1)和聚合酶鏈式反應程序。使用MassARRAY[16]對384只魯中肉羊進行基因分型,分型的具體過程見Zhang等[17]所示方法。

      1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

      用于計算多態(tài)信息含量、雜合度、有效等位基因數(shù)和卡方值(哈代溫伯格參數(shù))等群體遺傳學參數(shù)的方法詳見Zhang等[17]。

      yi=μ+Gi+ei模型用于GLIS1基因g.27775611 T>C位點與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析。式中:yi代表產(chǎn)羔數(shù);μ代表群體均值; Gi代表i種基因型的影響(i=1,2,3);ei代表隨機誤差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析由SAS (V. 8.1)完成,產(chǎn)羔數(shù)用平均值±標準誤表示。

      1.5 GLIS1蛋白的生物信息學分析

      綿羊的蛋白序列來自NCBI。ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)用于預測GLIS1蛋白的理化性質(zhì);TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)用來預測GLIS1的跨膜結(jié)構(gòu)域;SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于GLIS1蛋白信號肽的預測;Predictprotein(https://www.predictprotein.org/)用于預測GLIS1蛋白的二級結(jié)構(gòu);NCBI 保守域預測 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg) 用于預測GLIS1蛋白的結(jié)構(gòu)功能域;SCRATCH protein predictor(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/index.html)用于預測GLIS1蛋白的二硫鍵;NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)用于預測GLIS1蛋白的糖基化;NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )用于預測GLIS1蛋白的磷酸化位點。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 GLIS1基因多態(tài)性及其與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

      384只魯中肉羊的分型結(jié)果如圖1所示,結(jié)果表明384只魯中肉羊群體中存在3種基因型,分別是:CC型8只、TC型108只、TT型268只。對其進行群體遺傳學分析發(fā)現(xiàn)(表1):該位點的多態(tài)信息含量為0.24,屬于低度多態(tài)(P<0.25),該群體的卡方值為0.65,說明該群體處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。為探究該突變位點對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響,對384只魯中肉羊進行了產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2):在有產(chǎn)羔數(shù)記錄的3胎中,突變純合個體(CC)的產(chǎn)羔數(shù)顯著低于突變雜合個體(TC)和野生型(TT)(P<0.05),突變雜合個體(TC)的產(chǎn)羔數(shù)低于野生型(TT)(P>0.05),說明突變可以顯著降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)。

      2.2 GLIS1蛋白的生物信息學分析

      GLIS1蛋白的理化性質(zhì)預測表明:該蛋白由728個氨基酸組成,其分子量為77195.46 D,等電點為8.82,屬于堿性蛋白質(zhì)。從蛋白組成來看,其主要由20種氨基酸組成,其中脯氨酸(pro)含量最高為14.3%,而色氨酸(Trp)含量最低為0.4%。該蛋白在動物體內(nèi)的半衰期大約為5.5 h,不穩(wěn)定指數(shù)為65.93,脂溶性指數(shù)為64.67,親水平均值為-0.520,故該蛋白是一種不穩(wěn)定脂溶性的疏水蛋白。

      表1 g.27775611T>C位點在魯中肉羊中的群體遺傳學分析Table 1 The population genetic analysis of g.27775611T>C in Luzhong mutton sheep

      表2 g.27775611T>C位點不同基因型魯中肉羊不同胎次的產(chǎn)羔數(shù)Table 2 The litter size of different parity in Luzhong mutton sheep with different genotypes of g.27775611T>C

      該蛋白屬于膜內(nèi)蛋白(圖2A),并且無信號肽結(jié)構(gòu)。從預測的二級結(jié)構(gòu)來看,其暴露態(tài)(exposed)占47.76%,中間態(tài)(intermediate)為7.06%,埋藏態(tài)(buried)為45.18%,另外該蛋白還存在多個DNA、RNA和蛋白結(jié)合位點(圖2B)。其功能域預測結(jié)果顯示(圖2C):該蛋白在354-344處存在COG5048超家族結(jié)構(gòu)域即鋅指功能域,該結(jié)構(gòu)域可能對GLIS1蛋白的功能起重要作用。另外該蛋白存在26個半胱氨酸(cys),其形成了11個二硫鍵。

      為探究GLIS1基因突變前后蛋白功能的變化,對其突變前后糖基化和磷酸化位點的變化進行了預測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與突變前相比,突變后在其547位氨基酸增加了一個糖基化位點;與突變前相比(圖3A),突變后的GLIS1蛋白其547位氨基酸磷酸化位點丟失(圖3B),可能導致一些激酶無法在該位點結(jié)合(圖3C),進而可能導致其功能的變化。

      3 討 論

      GLIS1基因是一種Krüppel類似蛋白基因,由于其在小鼠卵母細胞內(nèi)高表達,猜測其對其他哺乳動物如綿羊的繁殖活動具有重要調(diào)控作用。關(guān)于該基因研究主要集中在其與干細胞活性,細胞重編程[18-19]以及某些疾病[20-21]。有研究表明GLIS1基因的多態(tài)性(rs797906)與中國人群帕金森疾病的發(fā)病率有關(guān)[22]。但關(guān)于該基因多態(tài)性對綿羊繁殖的影響鮮有報道。本研究中GLIS1基因g.27775611C>T位點與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān),該突變可以顯著降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)(P<0.05),說明其可以顯著影響綿羊的繁殖性能。

      蛋白是基因功能的執(zhí)行者,研究分析其蛋白的功能可以更好地解釋該基因?qū)Ψ敝承阅艿挠绊憽LIS1蛋白理化性質(zhì)預測結(jié)果表明,該蛋白是一種不穩(wěn)定脂溶性的疏水蛋白,其在動物體內(nèi)的半衰期大約為5.5 h,不穩(wěn)定指數(shù)為65.93,脂溶性指數(shù)為64.67,親水平均值為-0.520,其半衰期長,而其卻屬于不穩(wěn)定蛋白,與半衰期長蛋白穩(wěn)定的常理相駁[23],故推測其具有雙重活性[24]。信號肽預測表明該蛋白是一種沒有信號肽且不跨膜的蛋白,暗示該蛋白發(fā)揮功能可能在細胞核內(nèi),該結(jié)果與前人報道一致[10]。鋅指功能域是該蛋白的唯一功能結(jié)構(gòu)域,研究表明,該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍椎亩ㄎ黄饹Q定性作用[10];也有研究表明,Kruppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以作為其它基因如血管緊張素Ⅱ的靶基因,發(fā)揮其重編程的作用[25],結(jié)合本研究結(jié)果,推測其可能是其它可以影響綿羊繁殖力基因的靶基因,具體基因和相關(guān)機制有待驗證。

      氨基酸的糖基化和磷酸化對蛋白本身的功能具有重要影響。研究表明在小鼠雌激素受體基因16位絲氨酸的糖基化和磷酸化可以顯著影響該基因的轉(zhuǎn)錄,進而影響雌激素受體的功能[26]。在本研究中GLIS1基因突變前后其糖基化和磷酸化位點發(fā)生變化,該變化可能會導致該蛋白功能的改變,從而影響綿羊的繁殖活動。也有研究表明在有蹄動物孕期,某些因素如糖基化和磷酸化具有調(diào)節(jié)果糖降解的作用,進而促進懷孕動物外胚層細胞的增殖[27],從而提高懷孕成功率甚至產(chǎn)羔數(shù)。結(jié)合本研究中GLIS1基因突變對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響,推測突變后磷酸化和糖基化位點的變化可能在一定程度上降低魯中肉羊的繁殖力或者產(chǎn)羔數(shù),具體機制有待進一步探究。

      4 結(jié) 論

      本研究表明,GLIS1基因g.27775611T>C位點突變可以顯著降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)。生物信息學分析進一步發(fā)現(xiàn)該蛋白突變后其磷酸化和糖基化位點發(fā)生變化,該變化可能降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù);GLIS1基因g.27775611T>C位點突變屬于有害突變,在以后綿羊育種工作中應減少或避免該突變的發(fā)生。

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