非洲豬瘟病毒p30基因的原核表達(dá)及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立

吳繼陽(yáng)

摘要：目的，分析間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立以及非洲豬瘟病毒p了0基因的原核表達(dá)方式。方法，選擇120例AFR質(zhì)粒，按照隨機(jī)分組方式，將其分為觀察組與對(duì)照組，每組60個(gè)。對(duì)照組使用SDS一PAGE檢測(cè)方法，觀察組使用間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)比兩組檢測(cè)在非洲豬瘟病毒p30基因原核表達(dá)測(cè)算以及抗體檢測(cè)當(dāng)中的準(zhǔn)確性，特異性，靈敏性和重復(fù)性。結(jié)果，觀察組檢測(cè)準(zhǔn)確性高于對(duì)照組，具有顯著差異（P《0.05），觀察組檢測(cè)特異性高于對(duì)照組，具有顯著差異（P《0.05），觀察組檢測(cè)靈敏性高于對(duì)照組，具有顯著差異（P《0.05），觀察組檢測(cè)重復(fù)性高于對(duì)照組，具有顯著差異（P《0.05）。結(jié)論，使用間接ELISA抗體檢測(cè)方法在非洲豬瘟病毒p30基因原核表達(dá)測(cè)算以及抗體檢測(cè)當(dāng)中具有良好效果，檢測(cè)靈敏度，重復(fù)性均較高，可起到準(zhǔn)確的檢測(cè)效果。最終測(cè)算得出的靈敏度可達(dá)到1：1600，在短時(shí)間內(nèi)的重復(fù)性和批量重復(fù)性異系數(shù)均小于10%。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒;p30基因原核表達(dá);抗體檢測(cè)方法

非洲豬瘟病毒主要可以引起非洲豬瘟疾病，表征主要以高熱、淋巴結(jié)及臟器嚴(yán)重出血作為特征，具有較高的接觸傳染性，死亡率達(dá)到95%～100%。這種疾病不僅會(huì)嚴(yán)重影響?zhàn)B殖行業(yè)，還會(huì)影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動(dòng)物疫病進(jìn)行重點(diǎn)防治。檢測(cè)血清中非洲豬瘟病毒抗體間接ELISA抗體檢測(cè)方法可以對(duì)豬瘟p30基因原核表達(dá)方式進(jìn)行有效的測(cè)算，同時(shí)相對(duì)于采用SDS-PAGE檢測(cè)方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定?？梢愿佑行У靥岣邫z測(cè)的特異性，敏感性和重復(fù)性。從目前分析研究結(jié)果可以看出，使用間接ELISA抗體純化重組蛋白作為語(yǔ)言抗檢測(cè)進(jìn)行基因測(cè)算，可以更加有效地對(duì)基因進(jìn)行克隆，在原核表達(dá)載體測(cè)算當(dāng)中可以獲得顯著效果。同時(shí)，這種檢測(cè)還可以對(duì)Winston?boarding病毒測(cè)算系列的純化結(jié)果具有良好的優(yōu)化濃度效果。本文主要結(jié)合病毒抗體SDS-PAGE檢測(cè)方法以及間接ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行表達(dá)界定。

1材料與方法

1.1一般材料

在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)選擇120例非洲豬瘟p30基因的質(zhì)粒。采用試劑盒檢測(cè)方式，由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行p30基因合成，探討astarDNA聚合酶的含量，并通過(guò)連接酶質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒進(jìn)行有效檢驗(yàn)。

1.2方法

對(duì)照組參照genbank已經(jīng)公布的SDS-PAGE檢測(cè)方式進(jìn)行核苷酸序列測(cè)驗(yàn)，對(duì)上游引物ggtill以及下游引物酶切位點(diǎn)進(jìn)行保護(hù)堿基測(cè)算。引用工程最終由上海嘉寶娜公司合成，并測(cè)定p30基因完整的開(kāi)放閱讀框，除此之外，對(duì)基因進(jìn)行克隆以及質(zhì)粒的構(gòu)建，選擇PCR模板進(jìn)行擴(kuò)建PCR反應(yīng)的條件，在98C的范圍內(nèi)進(jìn)行預(yù)變性測(cè)算，測(cè)算時(shí)間為2分鐘。在98C范圍內(nèi)進(jìn)行變.性基因測(cè)算測(cè)算時(shí)間為十秒鐘，在56C范圍內(nèi)進(jìn)行退火測(cè)算，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為15秒鐘，在72C范圍內(nèi)進(jìn)行延伸變性實(shí)驗(yàn)，時(shí)間為45秒鐘，共32個(gè)基因循環(huán)序列組。測(cè)算之后，采用試劑盒回收方法，對(duì)于雙酶切p30基因片段核原核表達(dá)載體進(jìn)行回收，并在16C范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)24小時(shí)的重組質(zhì)粒檢測(cè)。檢測(cè)之后對(duì)Trace感受細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌液檢測(cè)，重組載體獲得為pet-30。

觀察組使用間接ELISA抗體檢測(cè)方法建立間接抗體檢測(cè)，首先對(duì)抗體最佳濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行確定，采用方正檢測(cè)方式分別將重組蛋白稀釋到37.1、18.6、9.34倍進(jìn)行孔檢測(cè)。其次在1：110：200濃度下，分別對(duì)測(cè)算事業(yè)進(jìn)行稀釋，稀釋之后在37C范圍內(nèi)進(jìn)行孵化，時(shí)長(zhǎng)為1小時(shí)，在38C范圍內(nèi)進(jìn)行孵化，時(shí)長(zhǎng)為10分鐘。對(duì)顯示效果進(jìn)行鑒定，挑選接近l.0的陽(yáng)性值，再經(jīng)過(guò)二次封閉液選擇之后對(duì)酶標(biāo)記濃度進(jìn)行二次檢測(cè)，通過(guò)臨界值分析在上述優(yōu)化時(shí)間范圍之內(nèi)進(jìn)行基因序列檢測(cè)，從而確定豬繁殖與呼吸倍數(shù)，從而判定陽(yáng)性特性值。

1.3觀察指標(biāo)

觀察兩組檢測(cè)重復(fù)性，靈敏度，特異性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SpSS21.0。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x士s）表示;計(jì)數(shù)資料以X2檢驗(yàn)，以率（%）表示。P《0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

觀察組重復(fù)性情況顯著好于對(duì)照組，兩組之間具有顯著差異（P《0.05）

觀察組特異性顯著好于對(duì)照組，兩組之間具有顯著差異（P《0.05）。觀察組敏感性情況顯著好于對(duì)照組，兩組之間具有顯著差異（P《0.05）。

3結(jié)論

使用間接ELISA抗體檢測(cè)方法在非洲豬瘟病毒p30基因原核表達(dá)測(cè)算以及抗體檢測(cè)當(dāng)中具有良好效果，檢測(cè)靈敏度，重復(fù)性均較高，可起到誰(shuí)確的檢測(cè)效果。最終測(cè)算得出的靈敏度可達(dá)到1：1600，在短時(shí)間內(nèi)的重復(fù)性和批量重復(fù)性異系數(shù)均小小10%。