高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中金剛烷胺、金剛乙胺

葛曉曉，舒蕊華

（江蘇省理化測試中心，南京 210042）

作為常見的抗病毒藥物成分，金剛烷胺是一種飽和三環(huán)癸胺的氨基衍生物。與金剛烷胺結構相似，金剛乙胺通過將金剛烷胺的氨基替換為乙胺基而得，也曾作為抗病毒藥物于1993 年被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于A 型流感病毒的預防和治療［1］。近年來，隨著金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的大量使用，大部分流感病毒對其已產(chǎn)生耐藥性，治療效果日趨降低［2］。金剛烷胺類藥物應用于獸醫(yī)臨床試驗，缺乏科學、規(guī)范、安全、有效的試驗數(shù)據(jù)，可能會對消費者的生命健康帶來潛在風險［3–4］。鑒于以上因素，目前多數(shù)國家已明令禁止金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的使用［5］。然而，由于金剛烷胺和金剛乙胺合成路線簡單、成本低廉，其在畜禽養(yǎng)殖中被違法投喂現(xiàn)象仍時有發(fā)生。由此可見，對于動物源性食品中金剛烷胺和金剛乙胺殘留含量的檢測具有重要的現(xiàn)實意義。

我國對于動物源性食品中金剛烷胺和金剛乙胺殘留含量的檢測方法主要有液相色譜法和液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法。高效液相色譜法抗干擾能力差，易受基質(zhì)效應影響，且容易出現(xiàn)假陽性。液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法雖具有更高的靈敏度和效率［6］，但樣品處理方法對檢測結果影響較大，一般采用C18（反相硅膠鍵合）柱或陽離子交換固相萃取小柱［7］凈化樣品或在樣品提取液中直接加入吸附劑［8］進行凈化。目前我國對于動物源性食品中金剛烷胺、金剛乙胺聯(lián)合測定方法的研究仍不多見。筆者建立高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)合測定法，對動物源性食品中的金剛烷胺和金剛乙胺進行同時測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1290–6470 型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：BAS224S–CW 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯集團；

高速分散均質(zhì)機：FJ–200 型，上海標本模型廠；

高功率數(shù)控超聲波清洗器：KQ–400KDE 型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速離心機：TGL–18 型，上海安亭科學儀器廠；

漩渦儀：WH–3 型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RE–2000B 型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB–IIIA 型，上海豫康科教儀器設備有限公司；氮吹濃縮儀：AutoVapS60 型，美國ATR 公司；有機系針頭過濾器：內(nèi)徑為0.22 μm，美國Crystalgen 公司；

金剛烷胺標準樣品：純度為98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

金剛乙胺標準樣品：純度為99.4%，美國斯坦?；瘜W化工公司；

D15-金剛烷胺標準溶液：0.3 mg／L，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心，使用時以甲醇稀釋成所需濃度；

無水硫酸鈉、正己烷、乙酸、乙腈：均為分析純，國藥集團；

N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）：粒徑為40～63 μm，美國安捷倫科技有限公司；

反相硅膠鍵合吸附劑（C18）：粒徑為40～60 μm，美國安捷倫科技有限公司；

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Honeywell公司；

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜

色 譜 柱：Agilent T3 柱(100 mm×2.1 mm，3 μm，美國安捷倫科技有限公司)；色譜柱溫度：40℃；進樣體積：1 μL；流動相：體積分數(shù)為1%的甲酸溶液–甲醇，流量為0.4 mL／min，梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

質(zhì)譜掃描采集方法：質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式（MRM）；質(zhì)譜離子源：ESI 電離源，采用正離子模式；噴霧器壓力：0.31 MPa；脫溶劑氣體：氮氣，溫度為300℃，流量為5 L／min；碰撞氣：高純氮氣；鞘氣：高純氮氣，溫度為350℃，流量為12 L／min；毛細管電壓：3 500 V；其它質(zhì)譜參數(shù)列于表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理方法

稱取均質(zhì)樣品2 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中，準確移取20μL 1 μg／mL 的D15-金剛烷胺標準溶液（作為內(nèi)標物），加入的乙酸–乙腈溶液（1∶100）20 mL，超聲10 min，過濾，加入無水硫酸鈉3 g、正己烷10 mL，渦旋1 min，以3 500 r／min轉速離心3 min。移除上層的正己烷層，將乙腈層倒入50 mL 茄形瓶中，于40℃旋干，準確加入1.0 mL 甲醇復溶。加入PSA 75 mg 及C1875 mg，渦旋30 s，取上清液，過0.22 μm 濾膜。精密量取濾液0.5 mL于離心管中，用30℃氮氣吹干，加入甲醇溶液0.5 mL，渦旋30 s，以10 000 r／min 轉速離心3 min，取上清液待測。

1.3.2 系列混合標準工作溶液的配制

溶劑標準工作溶液：分別配制金剛烷胺和金剛乙胺混合標準溶液和D15-金剛烷胺標準溶液各10 μg／mL 的母液，準確移取金剛烷胺和金剛乙胺混合標準溶液2，4，10，20，100，200 μL，D15-金剛烷胺標準溶液20 μL 于6 只10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液稀釋定容，配制成金剛烷胺和金剛乙胺質(zhì)量濃度均分別為2，4，10，20，100，200 μg／L，D15-金剛烷胺質(zhì)量濃度均為20 μg／L 的系列混合標準工作溶液。

基質(zhì)匹配標準工作溶液：取陰性空白樣品，除在樣品處理結束后加入D15–金剛烷胺標準溶液外，其余步驟均與上述過程相同，制得空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液配制與溶劑標準工作溶液濃度相同的系列基質(zhì)匹配標準工作溶液，臨用現(xiàn)配。

2 結果與討論

2.1 樣品處理

參 考 農(nóng) 業(yè) 部2483 號 公 告–6–2016［9］及GB 31660.5–2019［10］的要求，對萃取溶劑進行優(yōu)化。分別試驗了甲醇、乙腈、乙酸–甲醇（1∶100）、乙酸–乙腈（1∶100）的提取效果。結果表明，當加標量為1 μg／kg 時，純?nèi)軇┨崛r回收率較差。向溶劑中加入酸可以提高回收率，而加入乙酸的效果優(yōu)于甲酸。乙酸–乙腈溶液（1∶100）提取效果略優(yōu)于乙酸–甲醇溶液（1∶100）［11］，平均回收率為91.6%。因此選擇乙酸–乙腈溶液（1∶100）為提取溶劑。

參考GB 31660.5–2019 及文獻［12］［13］，比較了PSA，C18的凈化效果，結果表明同時加入等量的PSA 和C18回收率最好，因為肉類等樣品基質(zhì)相對復雜，加入PSA 和C18可以最大程度地去除多種有機酸、脂質(zhì)、色素、甾醇等［14］。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱

試驗考察了美國沃特斯有限公司的Waters Atlantis T3 柱(100 mm×2.1 mm，3 μm) 和Waters Sunfire C18柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)及美國安捷倫科技有限公司的Agilent Poroshell 120 EC–C18柱（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）3 種不同色譜柱對金剛烷胺和金剛乙胺的分離測定效果。結果表明，在同等條件下，上述3 種C18柱分離效果均較為良好。Agilent Poroshell 120 EC–C18柱耐高壓，但在本試驗梯度時間內(nèi)，短柱對于基質(zhì)分離的表現(xiàn)差于長柱。T3 柱和Sunfire C18柱在低pH 條件下均有良好的穩(wěn)定性。使用T3 柱和Sunfire C18柱時金剛烷胺和金剛乙胺的分離度和響應無明顯差異，但Sunfire C18柱壓較低。T3 柱更適用于強極性物質(zhì)的分離，本實驗中的目標物不是強極性物質(zhì)，選擇普通C18柱可以達到檢測目的，所以選擇Sunfire C18柱。

2.2.2 柱溫

分別選擇柱溫為30，35，40℃，考察金剛烷胺和金剛乙胺的分離效果。結果表明，在其它條件不變時，改變柱溫色譜峰響應與保留時間沒有明顯變化，但柱溫較高時，流動相的溶解度增大，柱壓明顯降低。考慮到色譜柱使用壽命，采用柱溫為40℃。

2.2.3 流動相及其組成

分別采用甲醇–水、乙腈–水作為流動相，發(fā)現(xiàn)色譜響應一般，色譜峰形較寬。由于金剛烷胺和金剛乙胺含有氨基，向流動相中加入適量酸能促進離子化效應并提高響應值［15］，因此在水相中加入適量的甲酸。采用體積分數(shù)1%的甲酸溶液–乙腈作為流動相時，色譜保留時間比采用體積分數(shù)1%的甲酸溶液–甲醇提前，而肉類樣品基質(zhì)復雜，較早出峰可能會有干擾［16］，因此采用體積分數(shù)1%的甲酸溶液–甲醇作為流動相。

2.2.4 進樣體積

GB 31660.5–2019 采用的進樣體積為10 μL，而常規(guī)進樣體積為1 μL，分別取進樣體積1，5，10 μL 試驗，結果表明，進樣體積為10 μL 時，即因儀器具有高靈敏度而導致過載,進樣體積為5 μL 時，在測定某些基質(zhì)較復雜的樣品時，會因雜質(zhì)響應過高而干擾目標物的檢測。進樣體積為1 μL 時，目標物的響應能滿足要求，并且基質(zhì)干擾較小。故選擇進樣體積為1 μL。

圖1 為在最佳實驗條件下金剛烷胺和金剛乙胺混合標準溶液的質(zhì)譜多反應監(jiān)測色譜圖。

圖1 金剛烷胺和金剛乙胺混合標準溶液質(zhì)譜多反應監(jiān)測色譜圖

由圖1 可見，金剛烷胺出峰時間為1.34 min，金剛乙胺出峰時間為3.35 min，兩者分離效果良好。

2.3 線性關系與檢出限

在1.2 儀器工作條件下，按照濃度由低到高的順序依次對1.3.2 配制的兩組系列混合標準工作溶液進行測定。金剛烷胺采用內(nèi)標法定量，以標準工作溶液的質(zhì)量濃度（x，μg／L）為自變量、以定量離子對色譜峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（y）為因變量進行線性回歸，得線性方程和相關系數(shù)；金剛乙胺采用外標法定量，以標準工作溶液的質(zhì)量濃度（x，μg／L）為自變量、以定量離子對色譜峰面積（y）為因變量進行線性回歸，得線性方程和相關系數(shù)。

基質(zhì)效應用基質(zhì)匹配標準工作溶液線性斜率除以溶劑配制標準工作溶液線性斜率計算［17–18］。

實驗發(fā)現(xiàn)用甲醇與用陰性基質(zhì)溶液配制標準工作溶液相比較，前者基質(zhì)效應較小，在樣品檢測時，可采用甲醇配制標準溶液以簡化操作。

采用標準添加法確定方法檢出限和定量限。以信噪比S／N≥3 確定樣品中金剛烷胺和金剛乙胺的檢出限，以信噪比S／N≥10 確定其定量限。

金剛烷胺和金剛乙胺的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限數(shù)據(jù)列于表3。

表3 線性范圍、線性方程、相關系數(shù)（r2）、檢出限和定量限

由表3 可知，金剛烷胺和金剛乙胺的質(zhì)量濃度在2～200 μg／L 范圍內(nèi)線性良好（r2>0.999 0）。檢出限分別為1.0，0.5 μg／L，定量限分別為5.0，2.0 μg／L。

2.4 加標回收試驗

隨機選擇5 種動物源性食品：雞蛋、雞肉、豬肉、豬肝和牛肉，添加水平為1，2，10 倍定量限，按1.3實驗方法進行樣品處理和測定，平行測定6 次，陰性豬肉加標樣品質(zhì)譜多反應監(jiān)測色譜圖如圖2 所示，測定結果列于表4。

圖2 陰性豬肉加標樣品質(zhì)譜多反應監(jiān)測色譜圖

由表4 可知，在5 種動物源性食品中，金剛烷胺和金剛乙胺的平均回收率為76.5%～108.3%，相對標準偏差為0.79%～3.2%（n=6），滿足檢測要求。

表4 金剛烷胺和金剛乙胺的加標回收試驗結果（n=6）

2.5 樣品檢測

隨機抽檢50 份雞蛋、雞肉、牛肉、豬肉和豬肝，采用建立的方法測定其中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量，測得1 份豬肉樣品中有金剛烷胺殘留，測定值為1.43 μg／kg。采用農(nóng)業(yè)部2483 號公告–6–2016 方法復核，結果一致。說明在畜禽養(yǎng)殖過程中，仍然有金剛烷胺被非法使用，需要予以重視并加強監(jiān)管。

3 結語

建立了檢測動物源性食品中金剛烷胺和金剛乙胺殘留的高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法采用乙酸–乙腈溶液提取、正己烷萃取、PSA 和C18凈化等樣品處理方法，檢測過程便捷、快速，檢測結果精確，該方法可為檢測復雜動物源性食品提供新的方法選擇。