分光光度法測定茶游離氨基酸總量標準溶液的選擇

周順珍，趙華富，郭燦，尹榮秀，李花，徐靜

（貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所，貴陽 550006 ）

茶葉中的游離氨基酸有20 多種，游離氨基酸總量是茶葉中所有游離氨基酸含量之和，是構成茶葉鮮爽味的重要物質，對茶葉品質影響較大［1–2］，游離氨基酸含量與茶葉品質呈顯著正相關，因此其檢測結果準確與否直接影響茶葉品質評價工作。

目前茶葉中游離氨基酸總量可由兩種方式獲得，一是利用國家標準檢測方法GB／T 8314–2013 《茶游離氨基酸總量測定》［10］，二是通過檢測游離氨基酸組分的含量，得到游離氨基酸總量。游離氨基酸組分的測定方法有高效液相色譜法、液相色譜–質譜聯(lián)用法、氣相色譜法和氨基酸分析儀法［3–9］等。GB／T 8314–2013 法因其經濟、簡便和快捷而被廣泛應用。但在實際應用中發(fā)現該方法存在問題。該標準規(guī)定可以使用“茶氨酸或谷氨酸”標準溶液制作標準曲線，而實際采用茶氨酸制作的標準曲線線性較差，難以獲得準確的結果［14］。由于選擇的標準樣品不一致，各檢測機構對同一樣品的測定結果存在較大差異。

筆者分別使用茶氨酸和谷氨酸標準溶液制作標準曲線，對測定結果進行比較，發(fā)現應首選谷氨酸作為GB／T 8314–2013 方法測定茶游離氨基酸總量的標準樣品。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電子天平：BSA224S–CW 型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；

紫外分光光度計：TU–1810 型，北京普析通用儀器有限責任公司；

恒溫水浴鍋：HH·SY21–Ni8 型，北京長源實驗設備廠；

超純水制備器：Molecular 型，重慶摩爾水處理設備有限公司；

L-茶氨酸標準樣品：編號為A0789，純度為98.923%，北京世紀奧科生物技術有限公司；

L-谷氨酸標準樣品：編號為GTL–710247，純度為99.92%，北京世紀奧科生物技術有限公司；

茶葉樣品：貴州省茶葉研究所茶葉質量檢測中心；

實驗用水：去離子水（實驗室自制）。

1.2 溶液配制

茶氨酸、谷氨酸標準儲備液：質量濃度均為1 mg／mL，分別精密稱取100 mg 茶氨酸和谷氨酸標準樣品于100 mL 容量瓶中，加適量水溶解后，定容至標線，搖勻。

茶氨酸和谷氨酸系列標準工作溶液：分別移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 茶氨酸、谷氨酸標準儲備液于10 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻。該系列標準工作溶液的質量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg／mL［10］。

磷酸氫二鈉溶液：稱取23.9 g 十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，分析純），用水溶解后轉移至1 L 容量瓶中，定容至標線，搖勻［10］。

磷酸二氫鉀溶液：稱取于110℃烘干2 h 的磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）9.08 g，用水溶解后轉移至1 L 容量瓶中，定容至標線，搖勻［10］。

磷酸鹽緩沖液：pH 8.0，分別取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀溶液，按照體積比95∶5 混合，搖勻［10］。

茚三酮溶液：0.02 g／mL，稱取水合茚三酮（純度不低于99%）2 g，加入50 mL 水和80 mg氯化亞錫（SnCl2·2H2O），攪拌均勻，分次加入少量水溶解，于暗處靜置24 h，過濾后用水定容至100 mL［10］。

1.3 實驗步驟

1.3.1 樣品預處理

稱取3 g（準確至0.001 g）磨碎茶葉樣品于500 mL 錐形瓶中，加沸蒸餾水450 mL，立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min 搖動一次），浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，殘渣用少量水洗滌2～3次，將濾液轉入500 mL 容量瓶中，冷卻后用水定容至標線，搖勻［11］。

1.3.2 標準曲線的制作

分別吸取1 mL 茶氨酸和谷氨酸系列標準工作溶液于一組25 mL 比色管中，各加pH 8.0 磷酸鹽緩沖液0.5 mL 和茚三酮溶液0.5 mL，在沸水中加熱15 min。待冷卻后用水定容至25 mL，放置10 min，用5 mm 比色杯，測定570 nm 波長處的吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程和相關系數。

1.3.3 樣品測定

準確吸取1.3.1 所得樣品溶液1 mL 于25 mL比色管中，加入磷酸鹽緩沖液0.5 mL 和茚三酮溶液0.5 mL，在沸水中加熱15 min，冷卻，用水定容至25 mL，放置10 min，用5 mm 比色杯，以試劑空白溶液作參比，于570 nm 處測定吸光度［10］。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

按照GB／T 8314–2013 方法，分別測定茶氨酸、谷氨酸系列標準工作溶液，制作標準曲線，計算線性方程和相關系數。兩個系列標準工作溶液吸光度測定值列于表1，線性方程和相關系數列于表2。

表1 茶氨酸、谷氨酸系列標準工作溶液測定結果

由表1、表2 數據可知，茶氨酸、谷氨酸系列標準工作溶液同一濃度下吸光度相差很大。通常認為當線性相關系數(r2)大于0.99 時，濃度與吸光度之間有顯著的線性相關性［12］。實驗數據表明，茶氨酸標準曲線的線性相關系數小于0.99，表明線性較差，不能滿足檢測要求；而谷氨酸標準曲線線性相關系數大于0.99，表明線性關系良好，可用作游離氨基酸總量測定的校正曲線。

表2 茶氨酸、谷氨酸標準曲線線性方程、相關系數

2.2 統(tǒng)計分析結果

分別采用茶氨酸、谷氨酸標準曲線，對茶葉樣品各平行測定15 次，采用SPSS 統(tǒng)計軟件對測定數據進行配對樣本t檢驗（雙尾總體檢驗）［16］，對測定數據進行轉換，構建新變量作為獨立樣本，樣本t檢驗結果列于表3。由表3 可知，利用茶氨酸標準工作曲線法測定的茶葉樣品中游離氨基酸總量平均值為4.413%，而谷氨酸標準曲線法測定的平均值為3.481%，標準偏差分別為0.789%，0.659%，說明谷氨酸標準工作曲線法測定茶游離氨基酸總量的精密度優(yōu)于茶氨酸標準曲線法，兩者測定值相差0.932%。配對t檢驗結果：t14=24.884，P<0.001，表明兩者的差異達到了顯著水平，拒絕H0假設，兩種標準工作溶液測定的游離氨基酸總量存在顯著差異。

表3 茶葉樣品測定及統(tǒng)計分析結果

2.3 加標回收試驗

向樣品中加入10 mL 質量濃度為1 mg／mL 茶氨酸或谷氨酸標準溶液，進行加標回收試驗，試驗數據列于表4。由表4 可知，茶氨酸標準曲線法平均加標回收率為68.28%，表明準確度不理想。而谷氨酸標準曲線法平均加標回收率為94.63%，表明谷氨酸標準曲線法測定結果準確度較高，適用于茶葉中游離氨基酸總量的測定。

表4 加標回收試驗結果

3 結語

根據茶葉中各種氨基酸的相對分子質量及含量，用加權法計算所得混合氨基酸的相對平均分子質量為147～150，與谷氨酸相對分子質量147.1 接近，而與茶氨酸相對分子量174.2 相差較大，表明單位質量濃度對應的光密度存在偏差［12–15］，且差異越大，檢測結果與真實值的偏差越大。周國蘭等［13］提出用茶氨酸制作標準曲線時需稱取174 mg 溶于100 mL 水中作為母液，然后制作標準曲線，從一個側面說明完全按照GB／T 8314–2013 方法采用茶氨酸標準曲線法測定，測定結果是不準確的，而采用谷氨酸制作標準曲線能滿足測定要求。因此建議茶葉中游離氨基酸測定的國家標準應該明確采用谷氨酸做標準樣品，取消茶氨酸作為標準樣品。