捻轉血矛線蟲與胃癌細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)建立

楊 怡，張紅麗，周靜茹，陳學秋，杜愛芳*

(1.浙江大學 動物科學學院 動物預防醫(yī)學研究所 浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室，浙江 杭州 310058；2.浙江省動物疫病預防控制中心，浙江 杭州 311199)

捻轉血矛線蟲能寄生于反芻動物皺胃引起嚴重的捻轉血矛線蟲病，偶爾也見于人和鼠等非適宜宿主[1-4]。該病的高發(fā)嚴重威脅著國內外畜牧業(yè)的發(fā)展，目前防治主要依賴于化學驅蟲藥物的使用。然而耐藥性的產生和有效疫苗的缺乏給防治工作帶來了新的困難，發(fā)展免疫學防治方法十分迫切[5-6]。探明宿主針對捻轉血矛線蟲的免疫應答規(guī)律是發(fā)展免疫防治的重要研究方向。

宿主能依賴Th2型保護性免疫力將感染的捻轉血矛線蟲清除于體外[7]。捻轉血矛線蟲被吞食后進入寄生階段，與宿主首先發(fā)生免疫關系的部位是皺胃細胞。線蟲鉆入胃壁吸食宿主營養(yǎng)，而胃組織急于通知宿主排出入侵的異物，此時宿主產生早期免疫應答。完整的早期免疫應答可以幫助宿主盡快建立保護性免疫力。線蟲入侵引起胃組織局部病理反應，包括形成多核巨細胞包圍壞死灶的肉芽腫、淋巴細胞和漿細胞浸潤包圍胃腺等。這些病理反應的發(fā)生對宿主后續(xù)的免疫應答有很重要的誘導作用。被攻擊受損的胃組織會發(fā)出危險信號警報因子如IL-33，通知機體迅速產生保護性免疫力，將線蟲快速清除[8]。據(jù)報道，胃組織及其附屬淋巴結應對感染的保護性免疫力，如分泌IL-5等細胞因子、誘發(fā)嗜酸粒細胞等聚集、促使杯狀細胞分泌更多黏液等[9-10]。

目前，針對早期免疫應答的研究多在感染動物體內進行，胃組織的狀態(tài)不能實時觀察記錄，且需基于動物的大量犧牲，樣品的采集、觀察和處理都不方便[11]?，F(xiàn)階段的體外培養(yǎng)技術僅使用培養(yǎng)基可使捻轉血矛線蟲三期幼蟲人工脫鞘后生長至四期幼蟲或成蟲產卵階段，但產出的卵不能孵化，也不能完成整個生活史[12-13]。體外培養(yǎng)得到的四期幼蟲早期能在特殊培養(yǎng)液中存活數(shù)周，即可以達到宿主體內早期免疫應答期間的線蟲生長狀態(tài)[14]。因此，為了使用方便的體外感染模型探明宿主對捻轉血矛線蟲的早期免疫反應，本試驗建立了捻轉血矛線蟲與胃癌細胞共培養(yǎng)模型，并在此基礎上研究了線蟲與胃癌細胞的相互作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試驗動物NaClO，Cell Trace Far Red DDAO-SE dye(Invitrogen)；Annexin V/PI apoptosis kit(Multisciences)；Apoptosis Positive Control Solution(Multisciences)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)；100×青-鏈霉素(Solarbio)；兩性霉素B(Solarbio)；Transwell Insert六孔板(Corning)；大鼠購于浙江省實驗動物中心。

1.2 細胞培養(yǎng)MGC-803和BGC-823由浙江大學醫(yī)學院周天華教授實驗室惠贈，MGC-803為人胃癌細胞，BGC-823為人胃腺癌細胞，以下簡稱MGC和BGC；使用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)傳代。

1.3 捻轉血矛線蟲三期幼蟲脫鞘共培養(yǎng)系統(tǒng)中使用的三期幼蟲需脫鞘，方法：將NaClO加至混有5 000條L3的1 mL水中，使其終濃度為0.2%，室溫下輕輕晃動約20 min；在解剖鏡下觀察脫鞘效率達90%以上，立刻轉移至離心管，10 000 r/min 離心1 min；吸去上清，加1 mL ddH2O重懸蟲體，10 000 r/min 離心1 min；吸去上清，如此重復3次。在超凈臺內加 1 mL線蟲-細胞共培養(yǎng)營養(yǎng)液重懸蟲體，置于37℃待用。線蟲-細胞共培養(yǎng)營養(yǎng)液為含10%FCS、1% 100×青-鏈霉素、2 mg/L兩性霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液。

1.4 氣液界面共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立共培養(yǎng)系統(tǒng)建立方法：在Transwell Insert六孔板的濾膜表面平鋪200 μL鼠膠原，置于超凈臺過夜風干；每孔濾膜上加入106個細胞，濾膜外加入700 μL 線蟲-細胞共培養(yǎng)營養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)(圖1)；吸去濾膜上培養(yǎng)液，每孔加入200 μL蟲體混懸液，開始共培養(yǎng)；濾膜外的線蟲-細胞共培養(yǎng)營養(yǎng)液需每天更換，培養(yǎng)條件均為37℃、5% CO2。

鼠膠原制備方法：取大鼠尾部洗凈，置于75%酒精浸泡30 min；將尾部剪開去掉皮毛，并剪成小段，抽出其中的銀色尾腱；將尾腱剪碎置于0.1%的醋酸中(0.02 g/mL)，4℃溶解，不時振蕩；48 h后取上清，4 000 r/min離心30 min；取上清分裝，-20℃ 保存。

1.5 線蟲和細胞相互作用現(xiàn)象的觀察線蟲-細胞共培養(yǎng)時，每天使用倒置顯微鏡觀察線蟲和細胞的生理狀態(tài)，并記錄比較。

圖1 線蟲-細胞氣液界面共培養(yǎng)示意圖[14]

1.6 線蟲食物來源試驗細胞用Cell Trace Far Red DDAO-SE dye染料染色后與線蟲共培養(yǎng)，觀察線蟲染色情況。方法：在Transwell Insert六孔板上加入200 μL鼠膠原，置于超凈臺過夜風干；12×106個細胞與染料(終濃度為24 μmol/L)在HBSS中混合于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育15 min，避光；200×g離心3 min，棄上清，加細胞培養(yǎng)液重懸；每孔濾膜上加入106個細胞，濾膜外加入700 μL 線蟲-細胞共培養(yǎng)營養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)；吸去濾膜上培養(yǎng)液，每孔加入200 μL蟲體混懸液，開始共培養(yǎng)；濾膜外的細胞培養(yǎng)液需每天更換，培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO2；將濾膜上的培養(yǎng)液吸出，400×g離心3 min，棄上清；500 μL HBSS洗滌蟲體沉淀3次，400×g離心3 min；用4%多聚甲醛和2%NaN3麻醉固定蟲體；400×g離心3 min，PBS重懸，吸取蟲體置于2%瓊脂糖平板上，在激光共聚焦顯微鏡590 nm LED光源下觀察。

1.7 流式細胞術共培養(yǎng)后用Annexin V/PI apoptosis kit和流式細胞術檢測線蟲引起胃癌細胞凋亡或壞死的情況。操作方法：用胰酶將六孔板濾膜膠原板上的細胞消化下來，1 000 ×g離心5 min，棄上清，取105個細胞，加500 μL 1×Annexin-binding buffer洗滌重懸；加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫下避光孵育5 min。流式細胞儀檢測：激發(fā)光波長為488 nm，分別用波長為530 nm和575 nm的濾器檢測熒光強度，使用軟件分析。

細胞凋亡陽性對照的制備方法：取5×105個細胞，用冰PBS洗滌2次，1 000×g離心5 min；棄上清，加500 μL Positive Control Solution，于冰上孵育30 min；1 000×g離心5 min，棄上清，用冰PBS洗滌后收集細胞，使用Annexin V/PI apoptosis kit進行熒光染色。

判斷方法：活細胞為FITC-/PI-，凋亡細胞為FITC+/PI-，壞死細胞為PI+。

1.8 熒光定量RT-PCR檢測細胞因子表達量變化常規(guī)方法提取羊T淋巴細胞和胃癌細胞的RNA并反轉錄，利用熒光定量RT-PCR方法檢測羊感染或線蟲-細胞共培養(yǎng)前后IL-33的表達量。IL-33及β-actin特異性引物序列見表1。

表1 IL-33及beta-actin特異性引物序列

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析細胞因子表達量和蟲體長度的表示方法為平均值±標準差，各組間的差異比較使用單向方差分析。

2 結果

2.1 捻轉血矛線蟲的生活方式線蟲-細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，捻轉血矛線蟲呈現(xiàn)弦運動和圓運動2種生活狀態(tài)(圖2)。

圖2 捻轉血矛線蟲的生活方式(線蟲-MGC共培養(yǎng)系統(tǒng))

2.2 線蟲的食物來源將胃癌細胞用遠紅外熒光染料進行染色后與線蟲共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)線蟲腸道中布滿紅色熒光(圖3)，說明線蟲在共培養(yǎng)系統(tǒng)中會進食細胞蛋白。線蟲腸道與生殖道相互捻轉，因此腸道中的紅色熒光呈現(xiàn)左右交錯的狀態(tài)。

2.3 線蟲的形態(tài)特征捻轉血矛線蟲與細胞共培養(yǎng)0,4,7 d時的蟲體長度分別為(981.5±24.3),(1 113.9±24.4),(1 157.0±47.6) μm，說明捻轉血矛線蟲在共培養(yǎng)系統(tǒng)中能夠生長，但是后期生長速度非常緩慢或是基本不生長。

2.4 線蟲和細胞的生理狀態(tài)以線蟲-BGC共培養(yǎng)系統(tǒng)為例，隨著共培養(yǎng)時間的增加，捻轉血矛線蟲活力逐漸下降，扭動頻率降低，呈現(xiàn)蜷縮狀的蟲體數(shù)量增多；貼壁細胞漸漸脫落，培養(yǎng)后期可見部分區(qū)域細胞幾乎完全脫落(圖4)。線蟲-MGC共培養(yǎng)系統(tǒng)中呈現(xiàn)相似的現(xiàn)象，這說明捻轉血矛線蟲和胃癌細胞之間互相具有傷害或是脅迫作用。

2.5 細胞狀態(tài)的檢測MGC和BGC的流式細胞術分析結果顯示(圖5)，相比較于共培養(yǎng)0 d，共培養(yǎng)4 d時MGC壞死(PI+)的比例由12.91%增加到53.25%，BGC壞死的比例由2.63%增加到24.81%，而MGC和BGC都沒有大量的凋亡，這說明捻轉血矛線蟲的存在傾向于誘發(fā)細胞的壞死而不是凋亡。

2.6 細胞中IL-33的表達量變化捻轉血矛線蟲感染3 d時羊T淋巴細胞中IL-33的表達量上升至感染0 d時的7.022倍；MGC與線蟲共培養(yǎng)4，7 d 時IL-33的表達量分別上升至共培養(yǎng)0 d時的2.520，4.180倍；BGC與線蟲共培養(yǎng)4，7 d時IL-33的表達量分別上升至共培養(yǎng)0 d時的1.732，5.150倍(圖6)。IL-33的表達量在捻轉血矛線蟲感染羊體內和共培養(yǎng)細胞內均顯著升高，表明其在宿主早期免疫應答過程中起重要作用。

圖3 共培養(yǎng)4 d時捻轉血矛線蟲進食胃癌細胞的狀態(tài) A～C.細胞為MGC；D～F.細胞為BGC

3 討論

捻轉血矛線蟲感染宿主后，在皺胃進行寄生，寄生環(huán)境為微氧的三維氣液界面黏膜隱窩，因此體外共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬體內寄生環(huán)境構造5%CO2氣液界面細胞小室，以期真實地反映體內感染免疫應答狀態(tài)。國內外學者對其他線蟲體外細胞共培養(yǎng)方法的探索也較多[15-21]，且共培養(yǎng)模型均能較好地模擬早期免疫應答。

捻轉血矛線蟲在共培養(yǎng)系統(tǒng)中呈現(xiàn)弦運動和圓運動2種運動方式，這反映了其在宿主胃組織中的生存狀態(tài)。線蟲在胃部的弦運動有助于爬行較遠的距離，而圓運動則有助于蟲體修建“隧道”鉆入胃隱窩進行寄生。進行弦運動的線蟲四處游走于細胞，進行圓運動的線蟲在局部不斷擠壓細胞，可能造成細胞無法正常貼壁，出現(xiàn)局部的光禿現(xiàn)象。捻轉血矛線蟲與細胞共培養(yǎng)能導致細胞的壞死，可能是因為蟲體進食或運動破壞了細胞質膜的完整性，還可能是由于線蟲分泌的毒害物質對細胞造成了損傷引起壞死。

圖4 捻轉血矛線蟲和BGC的生理狀態(tài)(比例尺大小為50 μm) A.共培養(yǎng)0 d；B.共培養(yǎng)4 d；C.細胞單獨培養(yǎng)4 d；D.共培養(yǎng)7 d

圖6 共培養(yǎng)系統(tǒng)細胞中IL-33的表達量 *示P<0.05

Cell Trace Far Red DDAO-SE dye染料是一種超長期細胞示蹤劑，用于對細胞進行熒光染色，觀察線蟲的食物來源。線蟲與染色細胞共培養(yǎng)后腸道中也出現(xiàn)了遠紅外熒光，可以判斷共培養(yǎng)過程中線蟲吸食攝取了胃癌細胞組分，充足的食物來源給線蟲提供了生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質。共培養(yǎng)系統(tǒng)中的線蟲能隨著培養(yǎng)時間的增加而長大，但其生長速度比在宿主體內慢，與細胞共培養(yǎng)7 d時的蟲體長度約與羊體內感染4 d的相似，即能發(fā)育至四期早期幼蟲階段。

隨著線蟲-細胞共培養(yǎng)時間的增加，細胞開始表達大量的IL-33。綿羊T淋巴細胞也能在捻轉血矛線蟲感染宿主后提高IL-33的表達量。捻轉血矛線蟲能在胃部建立隧道，體外共培養(yǎng)系統(tǒng)也顯示線蟲能進食細胞，因此胃部細胞的死亡可能誘發(fā)了IL-33的表達。IL-33是一種警報因子，能在體外與IL1RL1細胞表面受體結合，激活胞內的NF-B和MAP激酶，誘導極化T細胞中Th2細胞因子的產生；體內試驗發(fā)現(xiàn)IL-33能誘導IL-4、IL-5和IL-13的表達[8]。具有胃腸道線蟲抗性的綿羊在感染蛇形毛圓線蟲14 d時，空腸中IL-33的表達量增加了近30倍[15]。BALB/c小鼠感染鞭蟲后3 d開始在盲腸組織中表達IL-33[22]。鞭蟲易感的AKR小鼠在接受外源IL-33蛋白后能被誘導排出感染的蟲體，這可能是由于IL-33誘發(fā)的Th2細胞因子抑制了不適當?shù)募纳x特異Th1極化反應[22]。這樣看來，宿主能在胃腸道線蟲感染后提高體內的IL-33表達量抵抗寄生蟲。

基于共培養(yǎng)系統(tǒng)和體內感染時捻轉血矛線蟲生活習性、營養(yǎng)來源和生長發(fā)育的高度相似性，本試驗建立的線蟲-細胞氣液界面共培養(yǎng)系統(tǒng)可以為研究線蟲與宿主的早期感染狀態(tài)提供新的體外培養(yǎng)模型。該系統(tǒng)與體內感染模型相比有許多優(yōu)點，如可以觀察細胞與線蟲的實時狀態(tài)、細胞與線蟲作用條件的方便操控等。共培養(yǎng)系統(tǒng)中使用了人類胃癌細胞，是基于捻轉血矛線蟲也可以偶見于人類的感染[2]，且MGC和BGC的強貼壁能力和易培養(yǎng)性也能保證共培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞的穩(wěn)定性。與單純使用培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)能較真實地反映線蟲感染宿主后的早期發(fā)育及免疫應答，而前者僅能實現(xiàn)線蟲發(fā)育狀態(tài)的觀察。目前該培養(yǎng)系統(tǒng)的其中一個不足之處是只進行到共培養(yǎng)7 d的觀察研究，后期還將嚴格控制共培養(yǎng)系統(tǒng)的無菌環(huán)境，延長共培養(yǎng)時間，以便更完整地觀察線蟲發(fā)育過程，同時研究整個早期免疫應答過程。還有一個不足之處是細胞種類單一，宿主胃組織中存在多種細胞，以后的研究可以嘗試多種胃細胞混養(yǎng)后與線蟲進行共培養(yǎng)。