毛蕊異黃酮對肺腺癌SPC-A1細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

周立霞，關(guān)洪全，馬賢德，王丹

[1.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬 （珠海） 醫(yī)院，廣東 珠海 519100；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847；3.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001]

近年來，全世界肺癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，盡管手術(shù)、放療、化療、靶向和免疫治療等綜合治療措施能提高患者的治愈率，但是大部分患者生存率仍偏低[1]。因此，尋找新的肺癌治療方法顯得尤為迫切。我國應(yīng)用中草藥治病歷史悠久，中草藥具有活血化瘀、清熱解毒、扶正固本等功效，且其抗腫瘤毒副作用較小，不易產(chǎn)生耐藥性，備受患者青睞。目前研究結(jié)果顯示，中藥在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。因此，本研究探討中藥對肺癌患者的治療價(jià)值，以期為肺癌患者的多學(xué)科綜合治療開拓一種新的途徑。

毛蕊異黃酮是中藥黃芪有效活性成分之一，具有低毒、作用靶點(diǎn)多等特點(diǎn)[2-4]。大量流行病學(xué)研究表明，毛蕊異黃酮具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等多種活性，在預(yù)防和治療腫瘤上有廣泛的應(yīng)用前景。有研究報(bào)道，毛蕊異黃酮在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、骨肉瘤等腫瘤中都具有抗腫瘤作用[5-6]。但對肺癌的抗腫瘤作用機(jī)制的研究較少。CHENG 等[7]在毛蕊異黃酮抑制肺癌A549 細(xì)胞侵襲的體外研究中發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮可能通過抑制ERK1/2 通路下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制A549 細(xì)胞的侵襲。同時(shí)，在裸鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，生存曲線顯示毛蕊異黃酮可以明顯延長荷瘤小鼠的生存周期。

本研究以肺癌細(xì)胞系SPC-A1細(xì)胞為研究對象，探討毛蕊異黃酮對SPC-A1細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并初步探索其簡單機(jī)制，為臨床上毛蕊異黃酮的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人SPC-A1肺癌細(xì)胞株 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫），DMEM培養(yǎng)基 （美國Invitrogen公司），胎牛血清 （天津?yàn)蠊荆锂慄S酮 （美國Selleck公司），四甲基偶氮唑藍(lán) （MTT） 、Cyclin D1、CDK4、CDK6和GAPDH （美國Santa Cruz公司），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RT-PCR） 試劑盒 （大連寶生生物工程有限公司），引物合成 （北京華大基因）。

1.2 儀器與設(shè)備

超純水處理裝置 （明澈-D 24 UV，美國Merck Millipore公司），SANYO MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱 （日本三洋公司），激光共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5 Ⅱ （美國Leica公司），F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀 （美國BD公司），Applied Biosystems Veriti PCR儀 （美國Bio Rad公司），QuixellTM定量PCR儀 （美國Bio Rad公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀 （美國Miniopticon公司），Nanodrop 2000c分光光度計(jì) （中國Thermo公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組對照組：人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)基中不含毛蕊異黃酮；實(shí)驗(yàn)組 （分成25 μg/ml組、50 μg/ml組及100 μg/ml組） ：人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)基更換成含毛蕊異黃酮培養(yǎng)基，終濃度分別為25、50及100 μg/ml。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)以含10%胎牛血清的DMEM （表達(dá)載體） 培養(yǎng)基，在37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵化人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞株，傳代時(shí)用胰酶消化，以胰酶抑制劑終止消化。將人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞株以1×105個(gè)/ml 濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后，分別加入0、25、50及100 μg/ml 毛蕊異黃酮0.1 ml。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)取各個(gè)藥物濃度處理后的SPC-A1細(xì)胞，于0、12、24、36及48 h時(shí)間點(diǎn)，通過MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。以二甲基亞砜 （DMSO） 處理作為對照。于0、12、24、36及48 h分別加入5 mg/ml MTT 10 μl，培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔中加入DMSO 200 μl，溶解后在波長490 nm處記錄光密度 （OD） 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。藥物對細(xì)胞抑制率計(jì)算方法：細(xì)胞生長抑制率= （對照組OD值-藥物組OD值） /對照組OD值×100%，半數(shù)抑制濃度 （IC50） 計(jì)算方法：用細(xì)胞存活率做劑量對數(shù)圖，并按作圖法求出IC50值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)取處于對數(shù)生長期的SPC-A1細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，一組加入0、25、50及100 μg/ml的毛蕊異黃酮培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。另一組加入100 μg/ml的毛蕊異黃酮，培養(yǎng)細(xì)胞12、24及48 h。將收集的細(xì)胞離心洗滌后加入預(yù)冷的70%乙醇，吹打均勻，4℃過夜。磷酸鹽緩沖液 （PBS） 洗滌重懸細(xì)胞后，加入碘化丙啶染液，4℃染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.5 Hoechst33258染色SPC-A1細(xì)胞與NaCl、25、50及100 μg/ml 毛蕊異黃酮孵育48 h。孵育結(jié)束后，細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，然后用PBS 沖洗2次，加入10 μg/ml Hoechst 33258 室溫下染色5 min，用PBS 沖洗3次。熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 Westernblotting 取不同濃度毛蕊異黃酮處理48 h后的SPC-A1細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3次，裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞使其懸浮，提取出來的蛋白4℃、12 000 r/min 離心20 min。將提取出來的總蛋白電泳，將不同分子量的蛋白分離開來，再轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，接著孵育抗Cyclin D1、CDK4、CDK6 抗體 （1∶1 000）和抗GAPDH 抗體 （1∶1 000），在4℃條件下過夜。二抗 （1∶5 000） 孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，超敏發(fā)光液發(fā)光，用凝膠成像系統(tǒng)照相掃描對其灰度值進(jìn)行分析，以Cyclin D1、CDK4、CDK6 灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值表示其蛋白表達(dá)水平。

1.3.7 RT-PCR取不同濃度毛蕊異黃酮處理48 h后的SPC-A1細(xì)胞，用Trizol 法提取各組SPC-A1細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，在20 μl 總體積中取1 μg，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀及試劑盒進(jìn)行檢測。PCR 反應(yīng)條件為60℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，共50個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)至少重復(fù)3次。計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮抑制SPC-A1細(xì)胞增殖

0、25、50及100μg/ml毛蕊異黃酮分別作用于SPC-A1細(xì)胞12、24、36和48h后細(xì)胞增殖抑制率的變化采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)比較，SPC-A1細(xì)胞增殖抑制率有差異 （F=25.074，P=0.012） ；②各組比較，SPC-A1細(xì)胞增殖抑制率有差異 （F=67.536，P=0.003） ；③各組SPC-A1細(xì)胞增殖抑制率變化趨勢有差異 （F=18.536，P=0.026）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛蕊異黃酮可以顯著抑制SPC-A1細(xì)胞的增殖，且隨著毛蕊異黃酮濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增加，說明毛蕊異黃酮對細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。見表1和圖1。毛蕊異黃酮對SPC-A1細(xì)胞24、36及48h的IC50分別為71.2、30.4和22.6μg/ml。

2.2 毛蕊異黃酮提高SPC-A1細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：不同濃度毛蕊異黃酮作用SPC-A1細(xì)胞48h后，4組SPC-A1細(xì)胞凋亡率比較，采用方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見表2和圖2。

毛蕊異黃酮100μg/ml作用于SPC-A1細(xì)胞12、24和48h后對其細(xì)胞凋亡率的影響采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)比較，SPC-A1細(xì)胞凋亡率有差異 （F=46.148，P=0.004） ；②兩組SPC-A1細(xì)胞凋亡率有差異 （F=68.741，P=0.001） ；③兩組SPC-A1細(xì)胞凋亡率變化趨勢有差異 （F=14.536，P=0.032）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛蕊異黃酮可以誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著毛蕊異黃酮濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的凋亡率升高。見表3和圖3。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)SPC-A1細(xì)胞的增殖抑制率 （%，±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)SPC-A1細(xì)胞的增殖抑制率 （%，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與25 μm/l組比較，P＜0.05；③與50 μm/l組比較，P＜0.05。

組別 12 h 24 h 36 h 48 h對照組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 25 μg/ml組 8.89±0.08 34.56±1.83 47.56±1.78 56.67±0.85 50 μg/ml組 14.36±0.96①② 48.34±0.43①② 60.56±0.38①② 72.56±1.34①②100 μg/ml組 17.96±1.23①②③ 56.56±0.04①②③ 69.56±1.45①②③ 81.26±0.05①②③

圖1 不同濃度毛蕊異黃酮作用下SPC-A1細(xì)胞的增殖情況 （±s）

表2 不同濃度毛蕊異黃酮作用48 h后SPC-A1細(xì)胞凋亡率的比較 （%，±s）

表2 不同濃度毛蕊異黃酮作用48 h后SPC-A1細(xì)胞凋亡率的比較 （%，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與25μg/ml組比較，P＜0.05；③與50μg/ml組比較，P＜0.05。

組別 凋亡率對照組 4.56±1.26 25 μg/ml組 14.78±2.32①50 μg/ml組 26.49±4.65①②100 μg/ml組 42.78±2.16①②③F值 78.495 P值 0.001

圖2 不同濃度毛蕊異黃酮作用48 h后對SPC-A1細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 毛蕊異黃酮誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258 染色后熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)對照組幾乎所有細(xì)胞核形態(tài)完整，呈圓形，淡藍(lán)色，染色質(zhì)在核內(nèi)均勻分布；毛蕊異黃酮作用48h后，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，固縮狀或團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，邊集凝聚成大小不同的塊，形成凋亡小體。隨著毛蕊異黃酮濃度的增加，細(xì)胞核碎裂程度也明顯增加，具有凋亡形態(tài)的細(xì)胞數(shù)目也增加。見圖4。

2.4 毛蕊異黃酮抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白及mRNA表達(dá)

0、25、50及100μg/ml 毛蕊異黃酮分別加入SPC-A1細(xì)胞中，作用24h后，結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮可以抑制細(xì)胞在G1期進(jìn)行G1/S期的轉(zhuǎn)換，隨著濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期及G2/M期細(xì)胞比例降低，4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見表4。

不同濃度毛蕊異黃酮對Cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)的影響見圖4。不同濃度毛蕊異黃酮對Cyclin D1、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)的影響見表5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。不同濃度毛蕊異黃酮對Cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白及mRNA表達(dá)均有一定程度抑制作用，隨著藥物濃度的升高作用增強(qiáng)。

表3 100 μg/ml 毛蕊異黃酮作用不同時(shí)間后SPC-A1細(xì)胞凋亡率的比較 （%，±s）

表3 100 μg/ml 毛蕊異黃酮作用不同時(shí)間后SPC-A1細(xì)胞凋亡率的比較 （%，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與12 h比較，P＜0.05；③與24 h比較，P＜0.05。

組別 12 h 24 h 48 h對照組 1.01±0.02 1.02±0.01 1.00±0.03 100 μg/ml組 8.56±4.35① 24.65±3.76①② 42.78±2.16①②③

圖3 100 μg/ml 毛蕊異黃酮作用不同時(shí)間后對SPC-A1細(xì)胞凋亡率的影響

圖4 不同濃度毛蕊異黃酮作用48 h后SPC-A1細(xì)胞凋亡情況 （Hoechst33258 染色×200）

表4 不同濃度毛蕊異黃酮作用24 h后SPC-A1細(xì)胞周期分布 （%，±s）

表4 不同濃度毛蕊異黃酮作用24 h后SPC-A1細(xì)胞周期分布 （%，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

組別 G0/G1期 S期 G2/M期對照組 10.63±1.04 53.60±1.49 37.16±2.08 25 μg/ml組 16.58±1.27 50.07±2.02 34.04±1.67?50 μg/ml組 28.13±1.96? 44.89±1.46? 30.69±2.24?100 μg/ml組 41.58±3.34? 33.07±2.02? 25.04±1.96?F值 52.178 39.482 18.015 P值 0.001 0.006 0.021

圖4 不同濃度毛蕊異黃酮Cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)的影響

表5 不同濃度毛蕊異黃酮對Cyclin D1、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)的影響 （±s）

表5 不同濃度毛蕊異黃酮對Cyclin D1、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)的影響 （±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

組別 CyclinD1 mRNA CDK4 mRNA CDK6 mRNA對照組 1.03±0.01 1.00±0.02 1.01±0.03 CA 25μg/ml 0.82±0.17? 0.78±0.26? 0.80±0.09?CA 50 μg/ml 0.65±0.11? 0.63±0.06? 0.61±0.14?CA 100 μg/ml 0.43±0.09? 0.41±0.12? 0.45±0.13?F值 45.607 47.924 42.815 P值 0.003 0.002 0.004

3 討論

肺癌是惡性腫瘤中最常見的一種，其發(fā)病率和病死率仍在逐年升高。中醫(yī)中藥治療在改善腫瘤患者癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存期、減輕放化療毒副作用等方面獨(dú)具特色。從肺癌的病因病機(jī)、辨證論治和中西醫(yī)結(jié)合治療方面總結(jié)近幾年中非小細(xì)胞肺癌治療的經(jīng)驗(yàn)，提出中藥及中西醫(yī)結(jié)合治療在放化療階段及晚期患者的治療中起著不可忽視的作用[8]。毛蕊異黃酮是黃芪的主要有效成分，臨床前研究結(jié)果表明其活性化合物具有延緩多種腫瘤發(fā)展的作用[9]。毛蕊異黃酮可以影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的效果。毛蕊異黃酮對腫瘤的抑制作用主要表現(xiàn)在其抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。目前研究指出，毛蕊異黃酮可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的增殖[10]。Cyclin D1 是一類在細(xì)胞周期中含量呈周期性變化的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，與CDK4/CDK6 結(jié)合而形成復(fù)合物，加速細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)G1/S的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，毛蕊異黃酮通過抑制Cyclin D1蛋白及mRNA的表達(dá)，使細(xì)胞生長周期阻滯在G0/G1期來抑制細(xì)胞的增殖[11]。毛蕊異黃酮也可以通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，增加細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 活性來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。也有研究指出，毛蕊異黃酮可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路、Ras-Raf-p38 MAPK 信號通路、調(diào)控ERβ/miR-17 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者啟動(dòng)線粒體凋亡途徑等來影響腫瘤細(xì)胞的生長[13-14]。有學(xué)者證明，毛蕊異黃酮也可以通過影響MMPs或影響鈣黏素來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，毛蕊異黃酮可以顯著抑制人肺癌細(xì)胞株SPC-A1的增殖，并且其抑制作用隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)。毛蕊異黃酮能夠引起核固縮，形成凋亡小體，誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞凋亡。毛蕊異黃酮可以在蛋白與mRNA水平上抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白及mRNA的表達(dá)，即毛蕊異黃酮可以通過影響這些蛋白來起到對SPC-A1細(xì)胞增殖的抑制作用。

綜上所述，毛蕊異黃酮可以明顯抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，這為毛蕊異黃酮的臨床應(yīng)用提供更多的理論基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入探討研究。