外周血HMGB1、sTLR4表達與亞臨床絨毛膜羊膜炎相關(guān)胎膜早破及早發(fā)型敗血癥的關(guān)系

（成都市第二人民醫(yī)院 產(chǎn)科，四川 成都 610011）

胎膜早破是妊娠期常見并發(fā)癥之一，易導致新生兒出生7 d 內(nèi)出現(xiàn)早發(fā)型敗血癥（early onset sepsis,EOS）[1]。而絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis,CAM）是引發(fā)胎膜早破最重要的危險因素，尤其多見于亞臨床絨毛膜羊膜炎（histological chorioamnionitis,HCA）[2]。但由于HCA 缺乏典型的臨床癥狀和有效的實驗室診斷指標，目前只有依靠羊水穿刺和胎膜病理檢測作為診斷的金標準[3]：前者屬于侵入性檢查；而后者只能作為診斷指標，兩者都具有一定程度的臨床局限性，對早期診斷胎膜早破并預警EOS 意義不大。高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box-1,HMGB1）是較早發(fā)現(xiàn)具有高度保守序列的非組蛋白核蛋白，通過與Toll 樣受體4（toll-like receptor 4,TLR4）和晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor foradvanced glycation end products,RAGE）結(jié)合介導急慢性炎癥反應[4]，但是否可作為HCA 早期診斷分子和新生兒EOS的早期預警分子尚未見明確報道。因此筆者希望通過本研究探討HMGB1及其受體作為HCA及EOS 早期診斷血清生物標志物的可行性，并嘗試選擇適合的指標建立相應的非侵入性產(chǎn)前診斷模型，從而為臨床研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年5月—2018年4月成都市第二人民醫(yī)院產(chǎn)科收治的314例足月分娩的胎膜早破產(chǎn)婦的臨床資料。其中，男性新生兒169例，女性新生兒145例；年齡18～46歲，平均（32.48±8.65）歲；母體胎膜早破＞12 h。所有受試產(chǎn)婦產(chǎn)后胎盤組織均送病理檢測，根據(jù)該院病理科＞2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師閱片并確診是否發(fā)生HCA，分為HCA組135例和非HCA組179例。根據(jù)2011年《實用新生兒學（第四版）》[5]關(guān)于新生兒敗血癥的診斷標準，21例患兒確診為EOS。EOS診斷標準：①經(jīng)外周血標本病原菌抗原或DNA檢測呈陽性；②≥2條非特異性檢查指標異常，包括白細胞計數(shù)（WBC）＜5×109/L、血小板計數(shù)（PLT）≤1×1011/L、出生12 h 桿狀粒細胞/中性粒細胞（I/T）≥0.16、C反應蛋白（CRP）≥8μg/ml及微量紅細胞沉降率≥5 mm/h 等[5]。

1.2 納入標準和排除標準

1.2.1 納入標準①經(jīng)陰道足月分娩；②經(jīng)臨床表現(xiàn)、婦科陰道檢查、陰道液涂片檢查及羊膜鏡檢查確診為產(chǎn)婦胎膜早破，且胎膜早破＞12 h；③分娩前血常規(guī)檢查正常，無宮外感染；④具有母嬰完整的臨床資料；⑤由受試孕產(chǎn)婦簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準①分娩合并染色體異常、嚴重先天畸形、先天性心臟病及遺傳代謝性疾病新生兒的孕婦；②合并嚴重的免疫系統(tǒng)疾病、急慢性嚴重感染、血液系統(tǒng)疾病、伴有出血性疾病及惡性腫瘤的產(chǎn)婦；③生殖道畸形產(chǎn)婦。

1.3 方法

1.3.1 血液標本采集采集產(chǎn)婦第一產(chǎn)程靜脈血5 ml，置于采集管中，靜置30 min，3 000 r/min 離心5 min，收集血清，置于-80℃?zhèn)溆?；同時采集肘靜脈血3 ml，置于EDTA 抗凝管中，2 h 內(nèi)送檢。所有檢驗均由該院檢驗科完成。

1.3.2 血常規(guī)檢測采用DXC800 全自動生化分析儀（美國Beckman公司）檢測WBC、PLT、糖化血紅蛋白（HbA1c）等。采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（FPG）和餐后2 小時血糖（2 hPG）。采用免疫比濁法檢測CRP。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）收集受試對象外周循環(huán)血清，采用ELISA試劑盒檢測HMGB1、可溶性TLR4（sTLR4）、可溶性RAGE（sRAGE）水平。采用Elx808 全自動定量繪圖酶標儀（美國Bio-Tek公司）在450 nm 波長處測定光密度（OD）值。HMGB1、sTLR4、sRAGE ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差 （±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗或秩和檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制ROC曲線，影響因素的分析用多因素Logistic回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料及血液生物化學指標比較

HCA組與非HCA組年齡、分娩孕周、收縮壓、舒張壓、CRP、HbAlc、FPG、2 hPG及sRAGE比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而外周血WBC、HMGB1及sTLR4水平比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HCA組高于非HCA組。見表1。

表1 兩組一般臨床資料及血液生物化學指標比較 （±s）

組別 n年齡/歲分娩孕周 收縮壓/mmHg 舒張壓/mmHg WBC/（×109/L）CRP/（mg/L）HCA組 135 34.02±7.38 37.15±0.91 145.37±17.62 99.35±9.37 15.24±3.85 17.81±10.84非HCA組 179 32.28±8.11 37.32±0.78 142.41±15.70 97.32±10.34 12.76±3.62 15.53±9.75 t值 1.956 1.779 1.569 1.774 5.848 1.955 P值 0.051 0.076 0.118 0.077 0.000 0.052組別 HbAlc/% FPG/（mmol/L）2 hPG/（mmol/L）HMGB1/（ng/ml）sTLR4/（ng/ml）sRAGE/（ng/ml）HCA組 7.14±1.20 6.75±1.42 9.52±1.59 7.49±3.93 56.51±10.12 44.55±18.54非HCA組 6.97±1.05 6.46±1.37 9.19±1.44 3.61±3.54 34.37±8.86 47.53±16.52 t值 1.335 1.828 1.922 9.168 20.614 1.501 P值 0.183 0.069 0.056 0.000 0.000 0.134

2.2 胎膜早破孕婦發(fā)生HCA的影響因素

基于上述兩組各項指標的初步分析，進一步以是否發(fā)生HCA為因變量，以WBC、HMGB1及sTLR4作為自變量，以逐步向后條件參數(shù)方法進行多因素Logistic回歸分析（α入=0.05，α出=0.10；Backward：LR），產(chǎn)婦臨產(chǎn)外周血HMGB1是發(fā)生HCA的獨立危險因素（P＜0.05）；而sTLR4是發(fā)生HCA的獨立保護因素（P＜0.05）。見表2。

表2 影響HCA 發(fā)生的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

2.3 HMGB1、sTLR4、WBC 對HCA的診斷價值

經(jīng)ROC曲線分析，HMGB1、sTLR4、WBC 聯(lián)合診斷HCA的曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.864（95% CI：0.826，0.895），敏感性和特異性分別為0.686（95% CI：0.623，0.694）和0.901（95% CI：0.871，0.925）。見圖1。

2.4 胎膜早破產(chǎn)婦血清學指標、是否發(fā)生HCA與新生兒發(fā)生EOS的關(guān)系

圖1 外周血HMGB1、sTLR4、WBC 聯(lián)合診斷HCA的ROC曲線

追蹤新生兒EOS的發(fā)生情況，結(jié)果顯示21例（6.69%）新生兒發(fā)生EOS，其余293例（93.31%）新生兒未發(fā)生EOS。根據(jù)診斷結(jié)果，比較EOS組產(chǎn)婦和非EOS組產(chǎn)婦臨床資料及第一產(chǎn)程時血液生物化學指標，EOS組與非EOS組外周血HMGB1、sTLR4水平及是否合并HCA例數(shù)比較，經(jīng)非參數(shù)檢驗或t檢驗或χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），EOS組HMGB1、sTLR4水平高于非EOS組，合并HCA例數(shù)多于非EOS組。而兩組其余臨床資料及血液生物化學指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 HMGB1、sTLR4 對EOS的預測價值

經(jīng)ROC曲線分析，HMGB1、sTLR4 聯(lián)合預測EOS的AUC為0.888（95% CI：0.840，0.926），敏感性和特異性分別為0.861（95% CI：0.837，0.882）和0.768（95% CI：0.717，0.804）。見圖2。

表3 兩組臨床資料及血液生物化學指標比較

圖2 外周血HMGB1、sTLR4 聯(lián)合預測EOS的ROC曲線

3 討論

胎膜早破是指由于感染、胎膜發(fā)育不良、宮內(nèi)壓異?；蜃訉m功能異常等原因?qū)е路置淝疤ツぷ匀黄屏?，若胎膜破裂?4 h，新生兒發(fā)生敗血癥的風險將大大增加[6]。普遍認為CAM是發(fā)生胎膜早破最重要的危險因素之一，我國感染率較高[7]。但是由于大部分CAM患者在發(fā)病早期并不會出現(xiàn)典型的感染癥狀，臨床將其定義為HCA；只有部分晚期患者會出現(xiàn)體溫升高、血常規(guī)異常及陰道分泌物異味等情況。CAM對母嬰結(jié)局影響極大，＞40% CAM患者可發(fā)生早產(chǎn)，更是引發(fā)胎兒窘迫、宮內(nèi)感染、新生兒窒息及早期敗血癥等并發(fā)癥最重要的危險因素[8]。臨床一旦確診為CAM，需在抗炎基礎上及時終止妊娠，因此早診斷、早干預對改善CAM 妊娠結(jié)局及降低胎兒死亡率具有極其重要的臨床價值。

炎癥反應是機體通過識別一系列危險因子后對病原菌、創(chuàng)傷等危險事件作出的防御反應[9]。其中警報素就屬于一類內(nèi)源性危險因子，可以募集活化抗原提呈細胞，同時誘導固有免疫細胞應答[9]。HMGB1 屬于典型的警報素家族成員，定位于細胞核和細胞質(zhì)中，通過與TLR4和RAGE 受體結(jié)合，參與炎癥反應、免疫反應及細胞生物學行為調(diào)控等多種生理病理過程[10]。sTLR4與sRAGE是其受體在血清中的可溶形式。目前臨床逐漸有學者開始關(guān)注羊水中HMGB1與HCA的關(guān)系，但是鮮少有研究探討外周血中HMGB1及其相應受體對HCA的診斷價值。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)婦外周血中HMGB1和sTLR4水平與HCA的發(fā)生關(guān)系密切，且聯(lián)合WBC 可作為診斷HCA的有效指標，從而為建立非侵入性HCA 早產(chǎn)診斷模型奠定了實驗基礎。本研究中，HCA組孕婦HMGB1、sTLR4水平高于非HCA組孕婦，HCA組和非HCA組孕婦外周血sRAGE 水平比較無差異，說明同樣作為HMGB1 受體的可溶性片段，兩者在發(fā)生HCA 中扮演的角色存在一定的差異，而且產(chǎn)婦臨產(chǎn)外周血HMGB1是發(fā)生HCA的獨立危險因素，而sTLR4是發(fā)生HCA的獨立保護因素。sTLR4是由TLR4 mRNA 選擇性剪切體編碼的一種具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可溶性蛋白分子，而sRAGE則是RAGE 胞外段的截斷形式。KACEROVSKY 等學者[11]對102例孕婦進行羊膜穿刺檢測sTLR4水平，結(jié)果顯示羊水中sTLR4水平升高與HCA的發(fā)生呈正相關(guān)。推測主要是由于sTLR4與TLR4 受體胞外結(jié)構(gòu)域十分相似，可作為誘餌受體阻斷TLR4與HMGB1 配體結(jié)合，因此sTLR4 被認為是TLR4的負調(diào)節(jié)機制之一，在炎癥時水平會升高，可作為急性炎癥反應期診斷的生物標志物。而RAGE 屬于免疫球蛋白超家族成員，BASTEK 等學者[12]證實孕產(chǎn)婦分娩前外周血清sRAGE 水平與早產(chǎn)呈負相關(guān)，sRAGE 水平降低預示著早產(chǎn)發(fā)生的風險更高。HMGB1/RAGE是介導慢性炎癥的重要通路，因此在HCA 發(fā)生過程中，由TLR4介導的急性炎癥反應可能發(fā)揮更為重要的作用。

除此以外，CAM和HCA 都是引發(fā)EOS 最重要的獨立危險因素[13]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)和護理水平的提高，新生兒敗血癥的死亡率有所下降，但是仍然是導致早產(chǎn)兒或胎膜早破圍產(chǎn)兒死亡的重要原因。EOS是新生兒出生7 d 內(nèi)發(fā)生的全身炎癥反應，起病隱匿且進展迅速，加上免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，極易引發(fā)膿毒血癥甚至死亡，因此早診斷、早干預對降低死亡率、改善預后具有重要的臨床價值。目前國內(nèi)外最常使用的檢測手段包括外周血血常規(guī)、CRP、PCT及血培養(yǎng)等。血培養(yǎng)是公認的診斷新生兒細菌感染的金標準，但是由于培養(yǎng)時間長，對培養(yǎng)條件和血液標本要求較高；同時新生兒采血困難、血液標本量較少，因此導致早期陽性率較低，容易延誤病情。WBC、PLT及CRP 等非特異性指標作為EOS診斷的敏感性較低，因此筆者進一步考慮HMGB1是否也可作為EOS的預警分子。

筆者在證實HMGB1及其受體sTLR4 在CAM相關(guān)胎膜早破的產(chǎn)婦血清中水平升高，由此推斷HMGB1可能會參與炎癥因子造成的胎兒和新生兒損傷。既往有研究提出，HMGB1及其受體在感染性疾病所造成的的胎兒腦、肝等器官損傷中具有重要作用[14]。因此本研究中，筆者分析了HMGB1 對EOS的預警價值，且聯(lián)合sTLR4的預測效能較高。需要指出的是，筆者在分析HMGB1及其受體與EOS的關(guān)系時，并未采用新生兒的數(shù)據(jù)，主要是考慮到臨床可操作性，希望通過探討母體警報素HMGB1及其可溶性受體水平的生物標志物意義，構(gòu)建一個非侵入型預測模型。

綜上所述，HCA相關(guān)胎膜早破產(chǎn)婦血清中HMGB1及其受體sTLR4水平升高，有望成為早期診斷孕婦發(fā)生HCA 潛在的敏感性指標。此外母體外周血HMGB1水平升高是新生兒發(fā)生EOS的獨立危險因素，因此HMGB1和sTLR4 對預測新生兒EOS 也具有一定的臨床價值。