外源性H2S對糖尿病大鼠晶狀體透明度的影響及其作用機制△

房城 鄭秀茜 劉永武 趙良友 嚴妍 姜波 焦月華 劉樹民

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病的常見并發(fā)癥，幾乎所有的1型糖尿病患者和80%左右的2型糖尿病患者都會發(fā)生糖尿病性白內(nèi)障[1-2]。糖尿病性白內(nèi)障已經(jīng)成為糖尿病患者致盲的主要原因[3]。糖尿病患者白內(nèi)障發(fā)病率是非糖尿病患者的3～5倍[4]。

研究人員發(fā)現(xiàn)，H2S是與NO和CO有相似生物學(xué)特性的第3種氣體分子[5]。催化內(nèi)源性H2S生成的酶主要是5-磷酸吡哆醛依賴性酶，包括胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶[6]。H2S在抗炎、抗氧化等方面具有重要的作用[7]。糖尿病患者體內(nèi)TNF-α表達增加，TNF-α是引發(fā)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[8]。TNF-α通過旁分泌的方式影響胰島素分泌，并且能夠減少晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的生成[8]。白內(nèi)障的發(fā)生與炎癥反應(yīng)和AGEs在晶狀體中聚集過多有關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，H2S能減少糖尿病患者傷口組織中TNF-α生成[10]。本研究探討外源性H2S對糖尿病大鼠晶狀體透明度的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象、儀器及試劑取SPF級健康雄性SD大鼠15只作為實驗對象，體質(zhì)量200～220 g(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供；動物質(zhì)量合格證：201502579)。主要實驗試劑及儀器包括：鏈脲佐菌素、NaHS(美國Sigma公司)，血糖儀及血糖試紙(中國魚躍醫(yī)療股份有限公司)，ELISA檢測試劑盒(上海酶遠生物科技有限公司)。

1.2 糖尿病模型大鼠制備及動物分組將大鼠飼養(yǎng)1周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(50 mg·kg-1)。監(jiān)測大鼠造模72 h血糖濃度(當(dāng)血糖濃度大于16.7 mmol·L-1時，認定為造模成功)。按隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為3組，對照組(正常大鼠)、模型組(糖尿病模型大鼠)、治療組(糖尿病模型大鼠+NaHS處理)，每組5只。造模后，治療組大鼠每天上午腹腔注射NaHS(5 mg·kg-1)1次，對照組和模型組給予相同體積生理鹽水，連續(xù)給藥12周。本研究遵循《實驗動物管理條例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.3 晶狀體透明度觀察和ELISA檢測給藥12周末，將SD大鼠麻醉后取出眼球，將晶狀體剝離出來，放置在田字格十字交叉處觀察晶狀體透明度。將剝離的晶狀體用蛋白提取試劑盒提取蛋白后，按ELISA試劑盒操作，用純化的大鼠TNF-α、AGEs抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被抗體的孔中依次加入TNF-α、AGEs，再與辣根過氧化物酶標記的TNF-α、AGEs抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺顯色。用酶標儀在450 nm波長處測定光密度(D)值，依據(jù)標準曲線計算樣品中大鼠TNF-α、AGEs濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析各組數(shù)據(jù)，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組晶狀體透明度觀察結(jié)果給藥12周后，對照組大鼠晶狀體透明度良好，能夠清晰看到十字交叉。模型組晶狀體明顯混濁，看不到十字交叉。治療組晶狀體與對照組相比，出現(xiàn)輕微的混濁，但與模型組相比，晶狀體相對透明(見圖1)。

圖1 各組晶狀體透明度的變化A：對照組；B：模型組；C：治療組

2.2 各組大鼠晶狀體組織中TNF-α和AGEs濃度變化ELISA檢測結(jié)果顯示：模型組TNF-α和AGEs濃度均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；治療組TNF-α和AGEs濃度均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠晶狀體組織中TNF-α和AGEs濃度變化

3 討論

社會發(fā)展、人口老齡化、肥胖人口增長等因素促使糖尿病的發(fā)病率逐年升高[11]，而白內(nèi)障是糖尿病的早期并發(fā)癥之一。目前，對于糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床上也缺乏能夠徹底治療白內(nèi)障的特效藥物。因此，研究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制，對糖尿病性白內(nèi)障的治療和藥物研發(fā)具有重要的臨床意義。

白內(nèi)障是由晶狀體混濁所導(dǎo)致的視覺缺陷，影響眼睛的聚光和清晰成像。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，白內(nèi)障患者數(shù)已經(jīng)遠遠超過青光眼和老年性黃斑變性，成為致盲的主要疾病[12]。研究表明，TNF-α是導(dǎo)致糖尿病性白內(nèi)障的關(guān)鍵因素，TNF-α水平增高會導(dǎo)致糖尿病性白內(nèi)障[13]；另有研究表明，在2型糖尿病大鼠實驗中，H2S可以減少傷口TNF-α的生成，從而減輕炎癥反應(yīng)，促進傷口愈合[10,14-16]；本研究利用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法建立糖尿病大鼠模型，模型組大鼠晶狀體中TNF-α的表達高于對照組，治療組低于模型組，這與以往的研究結(jié)果類似[13-15]。AGEs在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體混濁中起關(guān)鍵作用[17]。AGEs在晶狀體中聚集是晶狀體出現(xiàn)混濁的主要原因，也是導(dǎo)致白內(nèi)障的重要發(fā)病因素[18]。AGEs的升高使結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生不可逆性改變，在晶狀體中蛋白積聚和高聚合物產(chǎn)生過多會引起視力異常[19]。本研究模型組大鼠晶狀體組織中AGEs的表達高于對照組；治療組大鼠晶狀體組織中AGEs的表達低于模型組。

綜上所述，本研究認為，TNF-α、AGEs信號通路參與了糖尿病性白內(nèi)障病理改變的發(fā)生與發(fā)展，而外源性H2S可以抑制糖尿病大鼠晶狀體組織中TNF-α、AGEs的表達，從而提高糖尿病大鼠晶狀體透明度。