淫羊藿總黃酮對干眼癥雄兔淚腺中Bax和Bcl-2表達(dá)的作用研究△

王方 萬咪咪 樂艷芝 王翰墨 杜莎莎 張興菊

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球5%～34%的人口受到干眼的困擾，而老年人已成為受干眼困擾的最大群體，干眼造成的各種臨床癥狀已明顯影響了患者日常生活[1]。老年人干眼癥發(fā)病的原因復(fù)雜多樣，與基礎(chǔ)疾病的發(fā)生、解剖結(jié)構(gòu)的改變、淚液分泌量的減少、瞼板腺功能障礙等均有關(guān)聯(lián)，其中因年齡增加或絕經(jīng)等原因致使的雄激素缺乏導(dǎo)致的干眼癥逐漸引起了關(guān)注[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體存在于人及動物的淚腺、瞼板腺以及結(jié)膜中，雄激素可有效避免淚腺炎癥反應(yīng)，加速細(xì)胞的新陳代謝，而雄激素的缺乏則與眼表穩(wěn)態(tài)的破壞息息相關(guān)[3-4]。研究證實(shí)，雄激素替代療法能增加淚液分泌量并延長淚膜破裂時(shí)間(BUT)，有助于維持淚膜的穩(wěn)定性[5]。還有研究證實(shí)，可擬雄激素的黃酮類化合物可以減少細(xì)胞凋亡[6]。而早在《本草綱目》中就被記載可以治療眼疾的淫羊藿提取物就有總黃酮的成分，由此我們推測，可以通過淫羊藿總黃酮的擬雄激素作用治療干眼癥。因此，本實(shí)驗(yàn)基于干眼癥雄兔觀察淫羊藿總黃酮對淚腺Bax和Bcl-2表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康1個(gè)月齡、體質(zhì)量2.0～2.5 kg的雄性新西蘭大耳白兔80只(SPF級，遠(yuǎn)交系)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑SDS-PAGE電泳儀和濕法轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)、脫色搖床(TY-80R,金壇市醫(yī)療儀器廠)、Tanon5200化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(海天能科技有限公司)。丙烯酰胺、亞甲丙烯酰胺、Tris-base、過硫酸銨、TEMED、甘氨酸、SDS(上海阿拉丁生化；PVDF膜(Millipore)、ECL發(fā)光液(Thermo)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天)、甲醇(分析純，南京化學(xué)試劑廠)、HCl(分析純，南京化學(xué)試劑廠)、淫羊藿總黃酮提取物(98.13% 朝藿定A、99.94% 淫羊藿苷，成都曼思特生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方式隨機(jī)將大耳白兔分為A組(空白組)、B組(手術(shù)組)、C組(淫羊藿總黃酮組)、D組(雄激素組)，每組20只。A組以生理鹽水灌胃進(jìn)行干預(yù)，每天一次，每次2 mL；B、C、D三組通過去除雄兔雙側(cè)睪丸與附睪建立干眼癥模型后分別以生理鹽水灌胃(每天一次，劑量為2 mL)、淫羊藿總黃酮灌胃(每天一次，劑量為0.06 g·kg-1)、丙酸睪酮肌肉注射(每天一次，劑量為0.25 mg·kg-1)進(jìn)行干預(yù)。每組根據(jù)喂養(yǎng)時(shí)間不同又分為A1～D1組(喂養(yǎng)1個(gè)月)和A2～D2組(喂養(yǎng)2個(gè)月)，每組10只。

1.2.2 干眼癥雄兔動物模型建立方法B、C、D三組新西蘭大耳雄兔摘除雙側(cè)睪丸及附睪：術(shù)前禁食水，30 g·L-1戊巴比妥鈉以50 mg·kg-1的劑量腹腔注射，待雄兔麻醉后仰臥并固定，碘伏消毒手術(shù)區(qū)域，鋪單，在陰囊中部做一2 cm的豎行切口，分離雙側(cè)睪丸包膜，將睪丸擠出后結(jié)扎睪丸動脈及輸精管，切除睪丸，縫合皮膚。術(shù)后3 d肌肉注射青霉素(200×103U·kg-1)預(yù)防術(shù)后感染。

1.2.3 眼表檢查及診斷A1～D1組雄兔于造模前及造模后2周、4周時(shí)，A2～D2組雄兔于造模后6周及最后一次給藥后分別進(jìn)行淚液分泌實(shí)驗(yàn)(Schirmer Ⅰ test，SIT)和BUT檢查，檢查標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]的標(biāo)準(zhǔn)。所有操作均由同一人進(jìn)行，要求所有兔被檢查的時(shí)刻、位置、光線、濕度及溫度均一致。

1.2.4 Western blot檢測各組凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)A1～D1組及A2～D2組分別在干預(yù)1個(gè)月、2個(gè)月后，于最后一次給藥結(jié)束后2 h，應(yīng)用30 g·L-1戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔內(nèi)注射麻醉，使用空氣栓塞法處死兔，即刻摘取淚腺，提取其上皮細(xì)胞RNA，使用Western blot法檢測。Western blot法的具體操作如下：稱取30 mg組織，混入500 μL RIPA裂解液，冰塊上研磨至無明顯沉淀后裂解30 min。完成后，轉(zhuǎn)移至預(yù)先冷卻的1.5 mL離心管(冰上操作)。4 ℃下12×106r·min-1離心5 min。吸取上清，即樣品總蛋白，放于-20 ℃保存。根據(jù)碧云天BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)需要分離蛋白的相對分子質(zhì)量調(diào)配相應(yīng)的分離、濃縮膠，4 ℃保存。將樣品總蛋白與5×SDS上樣緩沖液混合至1×的濃度，于沸水中煮5 min使蛋白變性后上樣電泳。濃縮膠電壓60 V下30 min，進(jìn)入分離膠后電壓80 V下電泳90 min。電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，常溫轉(zhuǎn)移到封閉液后在脫色搖床干預(yù)1 h。一抗孵育參照說明書按11000調(diào)配后于4 ℃孵育后用TBST液漂3遍，每次10 min。再將二抗用TBST按15000稀釋，常溫孵育2 h后TBST漂洗3次，每次10 min。用Thermo ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光按電化學(xué)發(fā)光，于Tanon凝膠成像儀下拍照，獲取圖片。得出目標(biāo)條帶Bax、Bcl-2光密度值與內(nèi)參GAPDH光密度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)的計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組基礎(chǔ)淚液分泌量比較造模前各組雄兔SIT值相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。造模后2周，B、C、D組SIT值開始減小，與A組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，且B組與C、D組兩兩相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，B、C組SIT值進(jìn)一步減小，且B組SIT值小于C組，差異仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，D組SIT值變化不大，C、D組SIT值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組基礎(chǔ)淚液分泌量比較

2.2 各組淚膜穩(wěn)定性比較造模前各組BUT值相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。造模后2周，B、C、D組BUT值開始減小，與A組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，且B組與C、D組相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，B、C、D組BUT值進(jìn)一步減小，且B組BUT值小于C組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C組與D組BUT值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組淚膜穩(wěn)定性比較

2.3 各組Bax蛋白相對表達(dá)量結(jié)果各組Bax蛋白表達(dá)量見圖1。 Western blot檢測結(jié)果顯示，B組Bax蛋白表達(dá)高于C組、D組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；C組Bax表達(dá)均高于D組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表3)。B2組、C2組、D2組Bax/GAPDH值均分別小于B1組、C1組、D1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表4)。以上結(jié)果說明，淫羊藿總黃酮可減少Bax在淚腺中的含量，其與雄激素的作用無明顯區(qū)別，且隨時(shí)間增加效果逐漸增強(qiáng)。

圖1 各組淚腺中Bax蛋白表達(dá)結(jié)果A：A1～D1組淚腺中Bax蛋白表達(dá)結(jié)果；B：A2～D2組淚腺中Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

表3 各組Bax蛋白表達(dá)量

表4 各組Bax/GAPDH值

2.4 Bcl-2蛋白相對表達(dá)量結(jié)果各組Bcl-2蛋白表達(dá)量見圖2。 Western blot檢測結(jié)果顯示，B組 Bcl-2 蛋白表達(dá)低于C組、D組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；C1組Bcl-2表達(dá)低于D1組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C2組Bcl-2 表達(dá)仍低于D2組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表5)。C2組較C1組Bcl-2/GAPDH值增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；D2組較D1組Bcl-2/GAPDH值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表6)。以上結(jié)果提示，淫羊藿總黃酮可提高淚腺中Bcl-2的蛋白含量，隨時(shí)間增加與雄激素效果的差別逐步減小，且效果逐漸增強(qiáng)。

圖2 各組淚腺中Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果A：A1～D1組淚腺中Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果；B：A2～D2組淚腺中Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果

表5 各組Bcl-2蛋白表達(dá)量

表6 各組Bcl-2/GAPDH值

3 討論

眼部屬于性激素作用的部位，淚腺、瞼板腺及角膜等眼表組織均可見雄激素受體[8]。目前干眼的理論大多基于淚腺組織單位，其病變可見于細(xì)胞凋亡、組織破壞、炎癥浸潤，致使腺體分泌功能下降甚至喪失[9]。因此，有學(xué)者認(rèn)為干眼癥的起始因素之一很可能是雄激素的下降[10]。有研究顯示，淚液分泌量與人體睪酮分泌水平呈正比，睪酮可抑制淚腺細(xì)胞的凋亡、壞死[11]。此外，低雄激素水平可加速Sj?gren綜合征的發(fā)展，并證實(shí)與淚腺炎癥、重癥干眼有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組雄兔淚液分泌量減少，淚膜穩(wěn)定性減低，由此可見，雄兔淚腺細(xì)胞的炎癥、凋亡與去勢導(dǎo)致的雄激素水平降低有直接關(guān)系，最終導(dǎo)致了干眼的形成。至少10個(gè)以上的基因構(gòu)成了Bcl-2家族，它們對凋亡的調(diào)控是經(jīng)構(gòu)成同二聚體、異二聚體來實(shí)現(xiàn)的，Bcl-2和Bax是相對的一組控制凋亡的重要基因[13]。Bcl-2可提高細(xì)胞生存率，減少因各種原因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Bax與Bcl-2功能相反，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 Bcl-2與Bax的比值及Bcl-2與Bax蛋白量的變化在細(xì)胞的生長與凋亡過程中起重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，使用雄激素后，在緩解兔淚腺炎癥浸潤的同時(shí)， Bax表達(dá)也同時(shí)降低，而Bcl-2、c-myb蛋白及雄激素受體mRNA都明顯增加[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，B組雄兔的Bcl-2表達(dá)顯著減少，Bax的表達(dá)顯著升高，而C組與D組的Bcl-2的表達(dá)顯著升高，Bax的表達(dá)顯著減少。綜上可知，干眼的形成脫離不了雄激素降低的因素，而因雄激素降低導(dǎo)致的淚腺細(xì)胞凋亡、壞死又與Bcl-2和Bax有著密不可分的關(guān)系。

迄今為止，雄激素替代是雄激素缺乏型干眼僅有的病因療法，但長期使用雄激素會導(dǎo)致前列腺肥大、前列腺癌、女性男性化等副作用，給患者帶來了長期的苦惱。因此，作為一個(gè)中醫(yī)人，亟需從中藥中找到可以替代雄激素的有效療法。淫羊藿的根、葉、花和種子等部位含有與雄激素化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的雜環(huán)多酚類的黃酮類化合物，可起到模擬雄激素的效果。淫羊藿總黃酮是一種天然藥物，資源豐富，分離提純工藝成熟，且其療效肯定[16]。過去，黃酮類化合物被明確證實(shí)有抗炎、抗氧化等效果，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)其可以刺激雄激素受體[17]，可激活雄激素受體α與β的轉(zhuǎn)錄活性，表現(xiàn)出植物雄激素樣作用，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[18]，發(fā)揮擬雄激素效果[19]，從而可以治療某些與雄激素水平低下相關(guān)的疾病，如干眼癥等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C1組和C2組均減緩了因雄激素水平降低導(dǎo)致的干眼的發(fā)展，使雄兔淚液分泌量增加，淚膜穩(wěn)定，且C2組與D2組的療效對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?，淫羊藿總黃酮療效與雄激素相當(dāng)，能夠有效代替雄激素進(jìn)行干眼癥的治療。

綜上所述，淫羊藿總黃酮可通過抑制淚腺細(xì)胞凋亡而治療因雄激素水平降低導(dǎo)致的干眼癥，淚腺中Bcl-2表達(dá)上升、 Bax表達(dá)下降可能是其發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。淫羊藿總黃酮可以開發(fā)為新的雄激素替代的中藥，以避免使用西藥進(jìn)行干眼癥治療所帶來的不良反應(yīng)。以后可以進(jìn)一步對淫羊藿總黃酮替代治療的用量、劑型及療程進(jìn)行臨床研究。同時(shí)干眼癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，期待從干眼癥發(fā)生的其他機(jī)制來研究淫羊藿總黃酮的治療作用。