甲巰咪唑治療Graves病誘發(fā)白細(xì)胞減少患者Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)因子的變化及意義*

尚恒，馬金剛，魏紅麗，楊華，范斌，路林峰

（滄州市人民醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.體檢中心，3.供應(yīng)室，4 心內(nèi)科，河北 滄州 061000）

Graves 病是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，細(xì)胞免疫功能的異常在其發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用[1]。甲巰咪唑是臨床中常用的治療Graves 病的藥物，它除了可抑制甲狀腺激素合成外，還可以快速調(diào)節(jié)Graves 病患者細(xì)胞免疫功能的異常，發(fā)揮治療作用[2]。但治療過程中常會誘發(fā)白細(xì)胞減少，其發(fā)生率可達(dá)10%左右[3]。那么甲巰咪唑治療Graves 病過程中出現(xiàn)白細(xì)胞減少患者與正常白細(xì)胞患者在治療前其外周血細(xì)胞免疫功能的異常是否存在不同，目前這方面的研究較少。

近年來Treg、Th17 細(xì)胞在自身免疫性疾病中的機制研究較多，Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡會導(dǎo)致Graves病的發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究擬通過分析甲巰咪唑治療Graves 病過程中出現(xiàn)白細(xì)胞減少患者與正常白細(xì)胞患者治療前外周血Th17/Treg 及其分泌的細(xì)胞因子IL-17、TGF-β 水平，探討細(xì)胞免疫功能的變化在甲巰咪唑誘發(fā)白細(xì)胞減少中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年12月—2018年6月于滄州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診或住院的初發(fā)Graves 病65 例患者作為研究對象。根據(jù)患者的年齡、病情和甲狀腺激素水平，給予甲巰咪唑[0.5～0.7 mg/（kg·d）]治療，并輔以普萘洛爾降低心率，根據(jù)甲狀腺功能（以下簡稱甲功）變化的情況，逐漸調(diào)整甲巰咪唑治療劑量，以甲巰咪唑治療的前3 個月作為觀察期。選取觀察期內(nèi)出現(xiàn)白細(xì)胞減少癥的Graves 病患者30 例作為白細(xì)胞減少組。其中，男性8 例，女性22 例；平均年齡（30.28±6.53）歲；平均病程（7.62±2.93）個月。選取正常白細(xì)胞Graves 病患者35 例作為正常白細(xì)胞組。其中，男性10 例，女性25 例；平均年齡（33.53±7.64）歲；平均病程（9.12±3.81）個月。選取同期來本院健康體檢者50例作為對照組。其中，男性20例，女性30 例；平均年齡（32.51±6.84）歲。Graves 病診斷依據(jù)《中國甲狀腺疾病診治指南》[5]：①高代謝的癥狀和體征；②觸診及B 超檢查彌漫性甲狀腺腫大；③血清總甲狀腺素（total tyroxine 4, TT4）、游離甲狀腺素（free tyroxine 4, FT4）增高，促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）減低；④眼球突出和其他浸潤性眼征；⑤脛前黏液性水腫；⑥促甲狀腺素受體抗體（thyrotropin receptor antibody, TRAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody, TPOAb）陽性。以上①～③項為診斷必備條件，④～⑥項為診斷輔助條件。白細(xì)胞減少癥診斷依據(jù)：外周血白細(xì)胞絕對計數(shù)持續(xù)＜4.0×109/L 定義為白細(xì)胞減少癥，外周血中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)＜2.0×109/L 定義為粒細(xì)胞減少癥，＜0.5×109/L 定義為粒細(xì)胞缺乏癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療前存在白細(xì)胞減少、肝功能損害患者；②其他自身免疫性疾以及近期有免疫抑制劑或者皮質(zhì)類固醇使用者；③亞臨床甲狀腺功能亢進(jìn)癥（以下簡稱甲亢）、妊娠、近期感染、各種惡性腫瘤及腎功能衰竭患者。由于本研究不探討甲巰咪唑誘發(fā)肝損害及其他不良反應(yīng)的情況，因此需排除甲巰咪唑治療后出現(xiàn)肝功能損害及其他不良反應(yīng)患者。本研究經(jīng)滄州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分離空腹抽取研究對象靜脈血5 ml，分離血清用于甲功、甲狀腺自身抗體及細(xì)胞因子的檢測?？崭钩槿⊙芯繉ο蟾嗡乜鼓o脈血5 ml，行Ficoll 密度梯度離心法分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，懸浮于RPMI 1640 培養(yǎng)液中。

1.2.2 Treg、Th17 細(xì)胞的分選Treg 細(xì)胞測定：將上述PBMC 與PE-抗人CD4 單克隆抗體（美國eBioscience 公司）、抗人CD25-APC（美國eBioscience公司）進(jìn)行細(xì)胞表面染色，用PE-抗人Foxp3 單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色，采用流式細(xì)胞分析儀（型號：FACS Calibur，美國BD 公司）檢測。Th17 細(xì)胞測定：將PBMC 懸液置于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入佛波酯（美國Alexis 公司）25 ng/ml，伊諾霉素（美國Alexis公司）1μg/ml 后，在37℃孵育箱中培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，加入PE-抗人CD4 單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色，用PE-抗人IL-17A 單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色，采用流式細(xì)胞分析儀檢測。用CellQuest 軟件分析數(shù)據(jù)，以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T 表示Treg、Th17 細(xì)胞百分比。

1.2.3 甲功及甲狀腺自身抗體的測定采用美國羅氏公司的Cobase601 型電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)測定游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine,FT3）、FT4及TSH 的水平，采用配套試劑盒。采用美國Beckman Coulter 分析儀通過免疫化學(xué)發(fā)光法測定甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody, TgAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab）及促甲狀腺激素受體抗體（thyrotrophin receptor antibody, TRAb）水平，均采用配套試劑盒。

1.2.4 細(xì)胞因子的測定采用ELISA 法檢測細(xì)胞因子，采用美國R＆D 公司生產(chǎn)的血清TGF-β、IL-17 ELISA 試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較

各組年齡、性別及病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），各組甲功、甲狀腺自身抗體水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），正常白細(xì)胞組、白細(xì)胞減少組FT3、FT4、TgAb、TPO-Ab 及TRAb 較對照組高，TSH 較對照組低，進(jìn)一步的兩兩比較顯示，白細(xì)胞減少組與正常白細(xì)胞組FT3、FT4及TPO-Ab 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），白細(xì)胞減少組較正常白細(xì)胞組高。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組外周血中Th17、Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比及Th17/Treg 比較

各組Th17 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），正常白細(xì)胞組、白細(xì)胞減少組均較對照組高（P＜0.05）。各組Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），白細(xì)胞減少組、正常白細(xì)胞組較對照組低（P＜0.05），進(jìn)一步的兩兩比較顯示，白細(xì)胞減少組與正常白細(xì)胞組Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組Th17/Treg 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），正常白細(xì)胞組、白細(xì)胞減少組均較對照組高（P＜0.05），進(jìn)一步的兩兩比較顯示，白細(xì)胞減少組與正常白細(xì)胞組Th17/Treg比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組外周血中Th17、Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比及Th17/Treg 比較 （±s）

表2 各組外周血中Th17、Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比及Th17/Treg 比較 （±s）

組別 n Th17/% Treg/% Th17/Treg白細(xì)胞減少組 30 3.36±0.61 3.15±1.11 1.26±0.67正常白細(xì)胞組 35 2.88±0.50 3.41±0.94 0.92±0.36對照組 50 1.44±0.32 7.40±2.71 0.23±0.11 F 值 187.201 62.929 69.803 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較

各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），白細(xì)胞減少組、正常白細(xì)胞組IL-17、IL-17/TGF-β 較對照組高（P＜0.05），TGF-β 較對照組低（P＜0.05），進(jìn)一步的兩兩比較顯示，白細(xì)胞減少組與正常白細(xì)胞組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較 （±s）

表3 各組TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比較 （±s）

IL-17/TGF-β白細(xì)胞減少組 30 15.60±2.79 4.50±1.56 3.96±1.81正常白細(xì)胞組 35 11.33±2.00 8.30±1.71 1.43±0.42對照組 50 6.62±1.20 15.25±3.33 0.46±0.15 F 值 201.391 186.692 126.876 P 值 0.000 0.000 0.000組別 n IL-17/（pg/ml）TGF-β/（pg/ml）

3 討論

Graves 病的發(fā)生、發(fā)展是在遺傳易感性和環(huán)境因素異常的背景下，導(dǎo)致抑制性T 細(xì)胞功能缺陷，輔助性T 細(xì)胞定向分化，體液免疫和細(xì)胞免疫相互作用，刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生促甲狀腺受體抗體，從而導(dǎo)致甲亢[6]。Th17、Treg 細(xì)胞作為新近研究的T 細(xì)胞亞群，在自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。Th17 細(xì)胞具有很強的致炎功能，其分泌的細(xì)胞因子可引起炎癥細(xì)胞的浸潤和組織破壞，與炎癥反應(yīng)的活動性和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[7]。Treg 細(xì)胞具有強大免疫抑制功能，它通過分泌TGF-β 等細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，而特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 在其分化中起著關(guān)鍵作用[8]。Th17 與Treg 細(xì)胞存在著相互拮抗的作用，Th17/Treg 細(xì)胞平衡，可維持機體處于免疫耐受穩(wěn)態(tài)；而在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病時，T 細(xì)胞的分化受到影響，Treg 細(xì)胞分化被抑制，Th17 細(xì)胞分化增強，使得Th17/Treg 細(xì)胞平衡受到破壞，從而導(dǎo)致機體的損傷[9]。

本研究中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞減少組及正常白細(xì)胞組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比及其分泌的細(xì)胞因子TGF-β 的水平較對照組明顯下降，而CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比及其分泌的細(xì)胞因子IL-17 的水平較對照組明顯升高，提示抑制性T 細(xì)胞功能缺陷，輔助性T細(xì)胞不適當(dāng)?shù)闹旅魠⑴c了Graves 病的發(fā)生，這也與BOSSOWSKI 等[4]研究結(jié)果一致。

甲巰咪唑是臨床中常使用的抗甲狀腺藥物，白細(xì)胞減少是甲巰咪唑治療Graves 病過程中常見的不良反應(yīng)，其發(fā)生率可達(dá)10%左右。而多數(shù)學(xué)者認(rèn)為甲巰咪唑治療Graves 病出現(xiàn)白細(xì)胞減少或缺乏是一個免疫介導(dǎo)的過程，可能與骨髓抑制、存在抗中性粒細(xì)胞自身抗體及影響粒細(xì)胞某些代謝通道的毒性作用有關(guān)[10]。那么Th17/Treg 細(xì)胞免疫功能的異常是否對甲巰咪唑誘發(fā)白細(xì)胞減少的發(fā)生產(chǎn)生了影響？本研究比較Treg細(xì)胞在白細(xì)胞減少組中與正常白細(xì)胞組的百分比發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞減少組雖然有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而比較Treg 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TGF-β 的水平發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞減少組較正常白細(xì)胞組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明Treg 細(xì)胞的數(shù)目在白細(xì)胞減少組雖然無明顯的降低，但其免疫功能的缺陷在白細(xì)胞減少組中更加明顯。比較兩組中Th17 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17 的水平的差異發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞的所占百分比以及IL-17 的水平在白細(xì)胞減少組中升高更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示白細(xì)胞減少組中可能存在更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。在Th17/Treg 比值方面，白細(xì)胞減少組中Th17/Treg 及IL-17/TGF-β 的比值最高，表明Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡在白細(xì)胞減少組中更加明顯，且向Th17 細(xì)胞漂移。由于抑制性T細(xì)胞功能明顯降低，致炎細(xì)胞功能亢進(jìn)，推測在白細(xì)胞減少組患者中存在更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡向Th17 細(xì)胞漂移參與了甲巰咪唑誘發(fā)白細(xì)胞減少的發(fā)生。

甲巰咪唑除了通過抑制甲狀腺內(nèi)過氧化酶系統(tǒng)，阻斷離子碘生成活性碘過程，減少甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸合成外，還可以通過調(diào)節(jié)Graves 病自身免疫紊亂發(fā)揮治療作用。COTE-BIGRAS 等[11]提到，經(jīng)甲巰咪唑治療后可以迅速提高Graves 病患者外周血Treg 細(xì)胞的水平，緩慢降低Th17 細(xì)胞水平，逐漸糾正Th17/Treg 免疫失衡，且Th17/Treg 免疫平衡穩(wěn)定的時間與Graves 病復(fù)發(fā)的時間呈正相關(guān)。推測由Th17 細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)外周血中性粒細(xì)胞的動員、募集發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，因此及時糾正Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡向Th17 細(xì)胞漂移，能夠減少甲巰咪唑誘發(fā)白細(xì)胞減少的發(fā)生，提高治療Graves 病的安全性。為臨床治療Graves 病提供新的免疫學(xué)依據(jù)。