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    葛枳總黃酮口服脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2020-09-24 03:25:28郭永梅胥彥琪
    科技視界 2020年26期
    關(guān)鍵詞:卵磷脂水相水浴

    郭永梅 胥彥琪

    化學(xué)性肝損傷是我國(guó)常見(jiàn)疾病之一,其發(fā)病率在呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),且無(wú)有效的治療手段。根據(jù)現(xiàn)代研究表明,在人及哺乳動(dòng)物的肝臟內(nèi),乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH2)構(gòu)成了乙醇脫氫酶體系,參與體內(nèi)乙醇代謝[1]。乙醇脫氫酶氧化體系是肝臟代謝酒精的一條重要途徑。葛根和枳椇子都是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中極具代表性的護(hù)肝藥物,二者對(duì)化學(xué)性肝損傷均具有顯著的保護(hù)作用[2-3],其主要有效成分為黃酮類的化合物,但其溶解度低、穩(wěn)定性差、口服具有首過(guò)效應(yīng),生物利用度低,如何提高黃酮類天然藥物的生物利用度,一直是藥劑學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)難題[4]。

    脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體,具有提高制劑穩(wěn)定性及藥物溶出的優(yōu)點(diǎn)[5]。將PHTF 制備成口服脂質(zhì)體制劑,以期其具備脂質(zhì)體優(yōu)點(diǎn),并能克服傳統(tǒng)劑型生物利用度低的缺點(diǎn),最終增加PHTF 在機(jī)體中吸收和口服生物利用度[6]。目前,尚無(wú)關(guān)于制備葛根-枳椇子配伍制備脂質(zhì)體的報(bào)道,故本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行相關(guān)研究,并對(duì)PHTF 口服脂質(zhì)體的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    T6 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);FA2004 電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;JSM-7500F 掃描電鏡(日本電子株式會(huì)社);MS-2000激光粒度分析儀(英國(guó)malvern 公司);KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TGL-16G 高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)

    1.2 藥品及試劑

    葛根總黃酮提取物(陜西森弗天然制品有限公司,批號(hào):GGE20180722 總黃酮≥85.0%);枳椇子總黃酮提取物(陜西森弗天然制品有限公司,批號(hào):JJZ20180814 總黃酮≥75.0%);蘆?。ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100080-201810);乙醇脫氫酶(sigma 公司,批號(hào):A3263)、乙醛脫氫酶(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):S10195);β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+,Roche 公司);磷酸二氫鉀(上海展云化工有限公司)、氫氧化鈉(上海展云化工有限公司);大豆卵磷脂(德國(guó)Lipoid Gmbh 公司);膽固醇(德國(guó)Merck 公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 PHTF 的配比對(duì)酶活性的影響

    2.1.1 ADH/ALDH2 酶活性的測(cè)定方法

    取具塞試管,加入pH7.4 磷酸鹽緩沖液2.0 ml、NAD+溶液0.188 mmol/ml,并加入一定濃度的樣品溶液及酶溶液(ADH 或ALDH2)0.2 ml,加蓋,25 ℃溫育5 min,加入相應(yīng)的底物溶液,立即用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于340 nm 測(cè)定吸光度A 值,以后每隔10 s 讀數(shù)一次,連續(xù)測(cè)定5 min,記錄結(jié)果,計(jì)算酶活力激活率。

    2.1.2 PHTF 配比對(duì)ADH 酶和ALDH2 酶活性的影響

    將PTF 與HTF 分別按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1:5的比例進(jìn)行配比,即得PHTF。分別精密稱取一定量不同比例的PHTF,制備成5.0 mg/ml 的供試品溶液,固定加樣量為0.5 ml。并對(duì)其復(fù)合物的酶激活能力進(jìn)行研究。不同比例的PHTF 對(duì)ADH酶和ALDH2 酶的影響如圖1 所示。從圖中可以看出,當(dāng)復(fù)合物中PTF 與HTF 的比例為1∶2 時(shí),復(fù)合物對(duì)ADH 酶的激活率為59.3%,對(duì)ALDH2 的激活率為54.5%,均維持較高水平,因此確定PTF 與HTF 配比為1∶2。

    圖1 葛根總黃酮-枳椇子總黃酮復(fù)合物對(duì)AND 酶和ALDH2酶活性的影響

    2.2 PHTF 含量測(cè)定

    2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱取蘆丁對(duì)照品10.32 mg,置于25 mL 容量瓶中,加60%乙醇適量,超聲溶解,再加60%乙醇稀釋至刻度搖勻,即得對(duì)照品溶液。

    2.2.2 供試品溶液制備

    精密稱取一定量的PHTF(約相當(dāng)于總黃酮10 mg),置于25 ml 容量瓶中,用適量60%乙醇超聲溶解,搖勻過(guò)濾,即得供試品溶液。

    2.2.3 UV 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

    采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定總黃酮含量。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液按顯色后,以隨行試劑為對(duì)照空白,于200~600 nm 波長(zhǎng)范圍掃描,見(jiàn)圖2。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在508 nm 波長(zhǎng)處均具有最大吸收,故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為508 nm。

    2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

    精 密 吸 取對(duì) 照 品 溶 液1 mL,1.5mL,2mL,2.5mL,3mL,3.5 mL,置于10 ml 容量瓶中,按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色,以隨行試劑為對(duì)照空白,照紫外-可見(jiàn)分光光度法在508 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度值。以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=5.1 460X+ 0.0 962(r = 0.9 996),結(jié)果表明,在0.0413 mg/mL~0.1445 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果如圖2。

    2.3 工藝優(yōu)化

    2.3.1 脂質(zhì)體制備采用逆向蒸發(fā)法

    分別取大豆卵磷脂、膽固醇適量,溶于30 mL 無(wú)水乙醇中,作為有機(jī)相;取總黃酮適量,溶于10 mL PBS(PH7.0)中,作為水相。將水相與有機(jī)相混合,水浴超聲處理,直至形成均勻乳劑,移至梨形瓶中,水浴減壓除去無(wú)水乙醇,達(dá)到膠態(tài)后滴加適量PBS 溶液(PH7.0),繼續(xù)減壓蒸發(fā)使其充分水化,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得。

    2.3.2 脂質(zhì)體包封率測(cè)定

    采用離心法。精密量取脂質(zhì)體1 mL,加50 mL 甲醇破乳后再稀釋10 倍,于508 nm 處測(cè)吸光度,計(jì)算PHTF 含量(W 總)。精密量取脂質(zhì)體上清液1 mL,10 000 r/min 離心30 min,取上清液10 μL,甲醇定容至5 mL,測(cè)定吸光度,計(jì)算游離PHTF 含量(W 游),計(jì)算包封率。

    2.2.3 藥物與卵磷脂比對(duì)包封率的影響

    固定處方及工藝中的其他因素不變,改變卵磷脂:藥物(w/w)的比例,分別按6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1 制成PHTF 脂質(zhì)體,測(cè)定其包封率分別為54.2%、58.3%、62.9%、59.6%、58.7%。結(jié)果表明藥物與卵磷脂的比例(w/w)為1∶10 時(shí)所制得的PHTF 脂質(zhì)體包封率最高。

    2.3.4 卵磷脂與膽固醇比例對(duì)包封率的影響

    固定處方及工藝中的其他因素不變,改變卵磷脂:膽固醇(w/w)的比例,分別按2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 制成PHTF 脂質(zhì)體,測(cè)定其包封率分別為53.4%、56.7%、61.2%、59.3%、55.2%。結(jié)果表明卵磷脂與膽固醇的比例(w/w)為4∶1 時(shí)所制得的PHTF 脂質(zhì)體包封率最高。

    2.3.5 有機(jī)相與水相比例對(duì)包封率的影響

    固定處方及工藝中的其他因素不變,改變有機(jī)相:水相(V/V)的比例,分別按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 制成PHTF 脂質(zhì)體,測(cè)定其包封率分別為52.5%、58.6%、62.4%、59.4%、55.2%。結(jié)果表明卵磷脂與膽固醇的比例(w/w)為4∶1 時(shí)所制得的PHTF 脂質(zhì)體包封率最高。

    2.3.5 水浴溫度對(duì)包封率的影響

    固定處方及工藝中的其他因素不變,考察水浴溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃,制備PHTF 脂質(zhì)體,測(cè)定其包封率分別為56.3%、58.3%、61.8%、60.3%、59.9%。結(jié)果表明,水浴溫度為40℃時(shí),PHTF 脂質(zhì)體包封率最高。

    2.3.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

    以包封率為主要指標(biāo),結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)水浴溫度(A);有機(jī)相與水相比例(V/V)(B);卵磷脂與膽固醇比例(w/w)(C);藥物與卵磷脂比(w/w)(D);四個(gè)因素進(jìn)行4 因素3 水平實(shí)驗(yàn),選用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn),制備PHTF 脂質(zhì)體,測(cè)定包封率。結(jié)果見(jiàn)表1。

    從表中按極差R 值大小排序,C>D>B>A,即卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比是影響包封率的主要因素。按照A2B3C2D1 組合制備的PHTF 脂質(zhì)體包封率為68.1%,優(yōu)于其他組合的包封率。因此確定水浴溫度為40℃,有機(jī)相與水相的比例為4∶1,卵磷脂與膽固醇的比例為4∶1,藥物與卵磷脂比例為1:8 為最優(yōu)處方。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

    按最優(yōu)處方制備3 批PHTF 脂質(zhì)體,測(cè)定其包封率分別為68.2%、68.4%、67.7%。平均包封率為68.1%。由測(cè)定結(jié)果可知該處方制備條件穩(wěn)定可行。

    2.5 PHTF 脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2.5.1 PHTF 脂質(zhì)體的外觀形態(tài)

    圖3 脂質(zhì)體電子顯微鏡圖

    按最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體,外觀為淡黃色乳狀液體。PBS(PH7.0)稀釋至適當(dāng)濃度,取適量滴于銅載體,1 min 后濾紙吸去多余樣液,2%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染,30 s 后濾紙吸去余液,晾干,于電鏡在觀察PHTF 脂質(zhì)體形態(tài)并拍照,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可見(jiàn),脂質(zhì)體外觀圓整,粒徑均一,為球狀或類球狀的小囊泡。

    2.5.2 粒徑分布

    取逆向蒸發(fā)法制得的PHTF 脂質(zhì)體,純水稀釋后測(cè)定粒徑,平行3 次,結(jié)果見(jiàn)圖5,測(cè)得平均粒徑為(160.7±12.0)nm,粒度分布較為均勻。

    2.5.3 Zeta 電位的測(cè)定

    取PHTF 脂質(zhì)體適量,純水稀釋后測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖5,3 批脂質(zhì)體Zeta 電位為(-41.4±2.3)mV,表明PHTF 脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

    圖4 脂質(zhì)體粒徑分布

    圖5 脂質(zhì)體Zeta 電位

    2.5.4 PHTF 脂質(zhì)體的載藥量

    表2 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

    取最優(yōu)工藝制備的3 批PHTF 脂質(zhì)體,通過(guò)離心法測(cè)定其載藥量,計(jì)算公式為,結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)證明逆向蒸發(fā)法制得的PHTF 脂質(zhì)體具有較高的載藥量,符合要求。

    2.5.5 穩(wěn)定性考察

    取3 批PHTF 脂質(zhì)體置于玻璃瓶中,將其在室溫條件(25℃)下放置60d,分別于0、7、15、30、60d 觀察其形態(tài)變化、平均粒徑、包封率、Zeta 電位及pH 值,結(jié)果見(jiàn)表2。在60d 的穩(wěn)定性考察中,PHTF 脂質(zhì)體外觀無(wú)變化,無(wú)渾濁,平均粒徑、包封率、Zeta 電位及pH 值基本不變,說(shuō)明PHTF 脂質(zhì)體在25℃條件下60d 內(nèi)穩(wěn)定。

    表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采用逆向蒸發(fā)法成功制備PHTF 脂質(zhì)體,并分別用單因素實(shí)驗(yàn)考察了各個(gè)因素對(duì)制備脂質(zhì)體的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用正交試驗(yàn)進(jìn)行了處方優(yōu)化??疾炝怂囟?、有機(jī)相與水相比例(V/V)、卵磷脂與膽固醇比例(w/w)、藥物與卵磷脂比(w/w),結(jié)果顯示逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體方法簡(jiǎn)單、效果良好。通過(guò)Valle-Hoch 法檢測(cè)不同比例的PHTF 對(duì)ADH 和ALDH2 的激活率的影響,確定PTF 和HTF 最優(yōu)配比為1∶2。通過(guò)正交試驗(yàn)確立了逆向蒸發(fā)法制備PHTF 脂質(zhì)體的最佳處方為藥脂比1∶8,磷脂膽固醇比4∶1,有機(jī)相與水相比例4∶1。并確定了制備工藝中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)的最佳水浴溫度為40℃。制得的PHTF 脂質(zhì)體為淺黃色的液體。

    通過(guò)三批次驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得PHTF 脂質(zhì)體平均包封率為68.1%,平均總黃酮含量為18.40%,證明制備方法可行,具有較好的含藥量。并通過(guò)初步穩(wěn)定性考察顯示,PHTF 脂質(zhì)體在常溫條件(25℃)下具有良好的穩(wěn)定性,60d 無(wú)明顯變化,從而確保了PHTF 脂質(zhì)體用藥安全性和穩(wěn)定性。

    本次實(shí)驗(yàn)僅考察了PHTF 體外分析方法的建立,且方法單一,不能有效評(píng)價(jià)PHTF 脂質(zhì)體的藥效及生物利用度。后續(xù)課題組將建立系統(tǒng)的、多指標(biāo)的評(píng)價(jià)分析方法,并進(jìn)行體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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