miR-499a-5p通過(guò)靶向APC減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞損傷的研究

武國(guó)利 張寧 田蜜 田征 許金鵬 馬競(jìng) 楊澤峰

【摘 ?要】目的：探討miR-499a-5p通過(guò)靶向APC減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞損傷的研究。方法：將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用含DMEM培養(yǎng)基（10 %胎牛血清）進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)、傳代，將正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組，將其用H2O2（100、200、400、800μmol/L）處理4 h，檢測(cè)細(xì)胞的存活率，篩選400μmol/L的濃度建立氧化應(yīng)激損傷模型，標(biāo)記為模型組，比較兩組的心肌miR-499-5p表達(dá)及APC表達(dá)。結(jié)果：模型組miR-499-5p表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而APC表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：miR-499a-5p可調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激，其機(jī)制與靶向抑制APC有關(guān)，為氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷提供了新的治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】心肌細(xì)胞損傷;氧化應(yīng)激;miR-499a-5p;APC

【中圖分類號(hào)】R197 ? ? ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? ? ?【文章編號(hào)】1672-3783（2020）07-0108-01

氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞凋亡是很多心臟疾病的重要作用機(jī)制，這也是心血管疾病治療的研究熱點(diǎn)。miRNA在人類疾病中的重要作用已經(jīng)得到大量研究的認(rèn)可，但是心血管疾病miR-499a-5p在心肌細(xì)胞損傷中的功能尚未完全清楚[1]?；罨鞍證（APC）是一種重要的生理抗凝劑，其由蛋白C介導(dǎo)的細(xì)胞途徑發(fā)揮直接的細(xì)胞調(diào)控，如抗炎活性、抗凋亡活性和內(nèi)皮保護(hù)障礙。據(jù)報(bào)道，APC在缺血再灌注心肌損傷中具有有益作用，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和炎癥具有抑制作用[2]。但是，其與miR-499a-5p在心肌氧化應(yīng)激損傷中的作用關(guān)系尚未清楚。本研究旨在探索miR-499a-5p在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用及其與APC之間的關(guān)系，以期可為氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷的治療提供新靶點(diǎn)。

1.資料與方法

1.1一般資料 采用深圳市百恩維生物科技有限公司生產(chǎn)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2，使用含DMEM培養(yǎng)基（10 %胎牛血清）進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)、傳代。將正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組，將其用H2O2（100、200、400、800 μmol/L）處理4 h，檢測(cè)細(xì)胞的存活率，篩選400μmol/L的濃度建立氧化應(yīng)激損傷模型，標(biāo)記為模型組。

1.2miR-499a-5p、APC的表達(dá)檢測(cè)方法： 采用qRT-PCR檢測(cè)，收集細(xì)胞，將細(xì)胞用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA。最后用qRT-PCR試劑盒操作，檢測(cè)細(xì)胞中miR-499a-5p、APC的表達(dá)。以U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct檢測(cè)細(xì)胞中miR-499a-5p、APC的相對(duì)表達(dá)量。20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物在42℃孵育15 min，加熱到95℃反應(yīng)2min。qRT-PCR條件在95℃10 s，然后 95℃，5 s，60℃，30 s，72℃，1 min，45個(gè)循環(huán)。引物信息（5'-3'）：miR-499a-5p 上游引物5'-AACAUCACAGCAAGUCUGUGCU-3'，下游引物miR-499a-5p 5'-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3';U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';APC上游引物5'-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3'，5'-GGCTACATCTCCAAAAGTCAA-3';GAPDH上游引物 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'[3]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1兩組miR-499a-5p、APC表達(dá)比較，見(jiàn)表1。

3.討論

miR-499-5p是進(jìn)化上高度保守的肌肉特異性micro RNA，其在心室中的表達(dá)明顯升高。臨床研究表明，在心肌缺血缺氧或氧化應(yīng)激狀態(tài)下，心肌細(xì)胞的miR-499表達(dá)發(fā)生改變，表現(xiàn)為miR-499表達(dá)降低，抵抗心肌細(xì)胞缺氧性損害。本研究結(jié)果顯示，模型組的miR-499-5p表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而APC水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。提示miR-499-5p可能參與心肌氧化應(yīng)激的病理過(guò)程中，而APC過(guò)表達(dá)能逆轉(zhuǎn)miR-499-5p對(duì)心肌細(xì)胞的損傷[4]。

綜上所述，miR-499a-5p可調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖、凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，臨床可通過(guò)靶向抑制APC，減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞損傷。

參考文獻(xiàn)

[1] 王曉景，張明星，陳小亮.miR-20a-5p通過(guò)靶向MRTFA緩解ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2019，27（9）：743-750.

[2] 王彥利，李紀(jì)明，羅進(jìn)光.miR-137靶向下調(diào)SETD7表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響研究[J].分子診斷與治療雜志，2019，11（6）：462-467.

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