高效液相色譜法測定黑色素瘤小鼠尿液中達(dá)卡巴嗪

岳玉華, 周炳均, 艾佳媛, 封 順

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 成都 610031)

圖 1 達(dá)卡巴嗪的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of dacarbazine

黑色素瘤是皮膚癌中惡性程度最高的一種腫瘤,近年來其發(fā)病率和死亡率急劇增加[1-4]。目前臨床治療黑色素瘤多采用手術(shù)切除、放療、化療和免疫治療等手段[5]。達(dá)卡巴嗪(dacarbazine, DTIC)是美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)的第一個治療黑色素瘤的化療藥物[6,7],目前仍被廣泛應(yīng)用于黑色素瘤的治療。DTIC在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝,但部分藥物仍以原藥形式經(jīng)尿液排出[8]。這就意味著可以通過監(jiān)測尿液中DTIC的含量來評估其在人體內(nèi)的利用率和轉(zhuǎn)化率,進(jìn)而對其治療效果進(jìn)行評價。

尿液作為唯一能夠在無損條件下大量獲得的體液,在生命分析中有著重要的地位。然而尿液成分相對復(fù)雜,基體干擾大,對尿液中微量或痕量組分的分析存在著一定困難。從圖1結(jié)構(gòu)式可以看出DTIC是一種強(qiáng)極性弱堿性化合物,這使得采用常規(guī)反相色譜分離時,DTIC會出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾;同時極性又非常大,使得其在C18柱上保留較弱,出峰時間過早,基質(zhì)干擾較大,難以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量[9]。為實現(xiàn)對尿液中DTIC的準(zhǔn)確分離與分析,人們進(jìn)行了大量工作,如Fiore等[10]以C18為分離柱,0.5 mol/L NaAc (10%的濃磷酸調(diào)到pH 7.0)和含25%乙腈的0.05 mol/L NaAc (10%的濃磷酸調(diào)到pH 5.5)為流動相,采用梯度洗脫的方式,初步實現(xiàn)了對尿液中DTIC的分析,但峰拖尾嚴(yán)重,效果不佳。Tate等[11]在流動相中引入甲酸銨,以0.1%甲酸銨水溶液(pH 5.5)/甲醇/水(90∶5∶5)為流動相,峰形得到了一定程度的改善,但DTIC在3 min即出峰,與死時間相隔過短。Safgren等[12]用三乙胺磷酸銨溶液代替甲酸銨水溶液,峰形得到進(jìn)一步改善。King等[9]也使用強(qiáng)酸性流動相(pH 3的磷酸緩沖溶液),但結(jié)果仍不令人滿意。如何快速、簡便、準(zhǔn)確地對尿液中DTIC進(jìn)行定量分析仍然是一個難題?；谏鲜鲈?本文通過改變流動相體系,采用甲醇/乙腈混合溶劑與磷酸鹽緩沖溶液,實現(xiàn)了在等度洗脫的條件下對色素瘤C57BL/6小鼠尿液中DTIC的分離與分析。

盡管DTIC作為一線化療藥物被廣泛用于黑色素瘤的治療,但其療效并不令人滿意,5年存活率僅為15%～20%[13,14]。為了提高其療效,臨床常推薦輔以營養(yǎng)助劑[15,16],但若是口服營養(yǎng)輔助劑使用不當(dāng),會增加患者的不良事件風(fēng)險[17,18]。藍(lán)莓為“水果之王”[19],富含花青素(anthocyanin),具有許多藥理作用[20-23]。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素也對黑色素瘤表現(xiàn)出一定的抑制作用。本文將所建立方法應(yīng)用于藍(lán)莓花青素(BA)輔助治療過程中小鼠尿液中DTIC含量的監(jiān)測,并對BA是否可作為黑色素瘤小鼠口服營養(yǎng)輔助劑進(jìn)行了初步研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀,配1525二元泵、2707自動進(jìn)樣器、2998二極管陣列檢測器(美國Waters公司)。高純水(艾柯純水儀)

色譜純甲醇、乙腈(美國Fisher公司),分析純丙酮、磷酸二氫鈉(成都市科隆化學(xué)試劑廠)。注射用達(dá)卡巴嗪(廣東嶺南制藥有限公司,批號:H20055753)、人工牛黃甲硝唑膠囊(重慶迪康長江制藥有限公司,批號:H50021645)、藍(lán)莓花青素(美國GNC,批號:196912)。

1.2 溶液配制

DTIC標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取DTIC 10.0 mg,加入適量甲醇溶解,在10 mL棕色容量瓶中用甲醇定容,制得1.00 mg/mL DTIC貯備液,置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人工牛黃甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取人工牛黃甲硝唑10.0 mg,用適量甲醇溶解后,于10 mL棕色容量瓶中用甲醇定容,制得1.00 mg/mL牛黃甲硝唑母液。以流動相進(jìn)一步稀釋,制得質(zhì)量濃度為250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液,置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜條件

色譜柱:Shimadzu-GL ODS柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相為甲醇/乙腈(1∶1, v/v)-0.01 mol/L磷酸二氫鈉(用1%氨水調(diào)節(jié)pH至6.5)(20∶80, v/v);洗脫時間:15 min;流速:1 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;牛黃甲硝唑為內(nèi)標(biāo)。

1.4 造模及給藥

健康C57BL/6雌性小鼠,體重18±2 g,購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司。自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后采用皮下注射法將B16-F10細(xì)胞(1×106個/mL)接種于小鼠右下腋,每只100 μL,正常組注射等量生理鹽水。每日觀察皮毛、食欲、活動及成瘤情況。造模成功后,隨機(jī)分為正常組(未接種腫瘤的正常黑色素瘤小鼠)、模型組(接種腫瘤但未進(jìn)行給藥的黑色素瘤小鼠)、BA組(22.5 mg/kg;灌胃給藥[i.g.];每日一次), DTIC組(70 mg/kg;腹腔注射[i.p.];每4日一次)、BA+DTIC組(BA及DTIC給藥方式同上),每組8只,正常組及模型組灌胃等量的生理鹽水,每日1次。每3天測量一次腫瘤體積,給藥結(jié)束后,小鼠脫頸處死(實驗流程見圖2)。

圖 2 實驗流程圖Fig. 2 Flow chart of experiment s.c.: subcutaneous injection; i.g.: intragastric administration; i.p.: intraperitoneal injection. Arrows were the time of DTIC administration and urine collection.

1.5 尿液的收集及處理

C57BL/6小鼠禁食12 h后給藥,然后用代謝籠收集尿液,每4天收集一次晨尿,共收集5次(如圖2所示)。將收集到的尿液在4 ℃下3 000 g離心10 min,除去固形物(2 h內(nèi)進(jìn)行)。上清液置于-80 ℃冰箱中保存。分析前,取出尿樣室溫下自然解凍,振蕩。取200 μL上清液于1.5 mL的EP管中,加入800 μL的冷丙酮(冷丙酮與樣品的體積比為4∶1),劇烈振蕩之后放入4 ℃冰箱中靜置30 min。4 ℃下12 000 g離心15 min以去除大分子,吸取上清液,真空冷凍干燥。樣品用1 mL流動相溶液復(fù)溶,0.22 μm濾膜過濾,然后進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

從圖1可以發(fā)現(xiàn),DTIC含有多個雜原子,極性較大,同時又含有多個氨基,說明其具有一定堿性。選擇常規(guī)流動相體系時,DTIC在C18柱上的保留較弱,同時會出現(xiàn)峰形拖尾的情況。為改善峰形,增加保留時間,提高定量準(zhǔn)確性,考察了DTIC在不同pH值的緩沖鹽體系(磷酸鹽、醋酸銨等)、乙腈、甲醇及乙腈/甲醇不同體積比的混合液等流動相體系中的保留行為,以保留時間和分離度為指標(biāo),確定最優(yōu)色譜條件(見1.3節(jié))。在此條件下正常組小鼠尿液樣品和正常組小鼠加標(biāo)尿液樣品的色譜圖見圖3。從圖3中可以看出,達(dá)卡巴嗪保留時間在5.3 min,尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)對達(dá)卡巴嗪干擾少,峰形良好。

圖 3 (a)正常組小鼠尿液樣品、(b)正常組小鼠加標(biāo)尿液樣品和(c)DTIC組小鼠尿液樣品的色譜圖Fig. 3 Typical HPLC chromatograms of (a) urine samples of normal mice, (b) spiked urine samples of normal mice and (c) urine samples of DTIC groupDTIC: 5.3 min; metronidazole: 9 min.

表 1 DTIC在C57BL/6小鼠尿液中3個加標(biāo)水平下的

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性范圍及檢出限

分別向正常組小鼠尿液樣品中加入適量DTIC貯備液,配制質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、1.00、10.0、100、250、500和1 000 μg/mL的系列工作溶液,經(jīng)HPLC分析。以DTIC質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,線性方程y=3 580x+39 362(r2=0.999),結(jié)果表明在0.25～1 000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,DTIC的檢出限和定量限分別為0.12 μg/mL和0.25 μg/mL(基于信噪比(S/N)=3和S/N=10)。

2.2.2回收率和精密度

移取已知含量的DTIC標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量,用正常組尿液稀釋至低、中、高3種質(zhì)量濃度(50.0、375、500 μg/mL)作為待測溶液,經(jīng)1.5節(jié)處理后,HPLC測定。由表1可見3個加標(biāo)水平下的平均回收率在98.9%至102%之間,RSD小于3.2%。

取正常組尿液,加入一定量達(dá)卡巴嗪對照品溶液,配制成質(zhì)量濃度為50.0、250、500 μg/mL的樣品,在優(yōu)化后的色譜條件下測定。同一天重復(fù)測定6次,連續(xù)測定3 d,分別考察日內(nèi)和日間精密度。該法日內(nèi)和日間RSD均在5%以內(nèi),見表2。上述結(jié)果表明所建方法重現(xiàn)性良好,可應(yīng)用于黑色素瘤小鼠尿液中DTIC的測定。

2.3 藍(lán)莓花青素對達(dá)卡巴嗪治療黑色素瘤的影響

將圖2收集到的5個尿樣經(jīng)1.5節(jié)處理,在優(yōu)化后的色譜條件下進(jìn)行分析,計算出尿液中DTIC的含量。從表3中可以發(fā)現(xiàn),在第1次到第3次給藥期間,DTIC組黑色素瘤小鼠尿液中DTIC含量呈下降趨勢,說明DTIC的利用率逐漸升高;但到第4和第5次給藥,DTIC利用率大幅下降,此時黑色素瘤已惡化至晚期。而在黑色素瘤早期和中期,由于BA的引入導(dǎo)致BA+DTIC組對DTIC的利用率增加;但在黑色素瘤晚期時,BA的引入并不能促進(jìn)小鼠對DTIC的利用。

表 3 不同給藥次數(shù)C57BL/6小鼠尿液中DTIC的含量(n=3)

圖 4 BA/DTIC對黑色素瘤C57BL/6小鼠(a)體重和(b)腫瘤體積的影響(n=3)Fig. 4 Effect of BA/DTIC on (a) body weight and (b) tumor volume in C57BL/6 mice (n=3)

為進(jìn)一步研究,我們對小鼠體重和腫瘤體積隨時間的變化進(jìn)行了統(tǒng)計。從圖4a中可以發(fā)現(xiàn),隨著腫瘤的增加,模型組及BA組小鼠體重增加。但是與正常組相比,各組小鼠體重?zé)o顯著性差異(p>0.05)。由圖4b可知,模型組腫瘤體積增長最快。DTIC組和BA組腫瘤體積較模型組增長速度均變緩(p<0.05),表明BA及DTIC都具有一定抑制黑色素瘤生長的作用。然而BA+DTIC組的腫瘤生長速度顯著高于DTIC組(p<0.05),這又意味著BA作為營養(yǎng)輔助劑與DTIC共同作用于黑色素瘤C57BL/6小鼠時,BA的攝入沒有起到提升療效的作用,反而在一定程度上降低了DTIC對黑色素瘤小鼠的療效,而該結(jié)果與尿液中達(dá)卡巴嗪含量測定結(jié)果存在矛盾。

花青素及其代謝產(chǎn)物是細(xì)胞色素P450酶(CYP450)的弱抑制劑。同時Mauray等[24]發(fā)現(xiàn)越橘中提取的花青素可以下調(diào)細(xì)胞色素P450亞酶CYP2E1的表達(dá),DTIC在肝臟中要通過CYP450激活才能產(chǎn)生作用,其中CYP1A2和CYP2E1起重要作用。藍(lán)莓中的花青素與其他植物中提取的花青素具有相同的母核,因此性質(zhì)相似。推測BA的引入對CYP450酶代謝造成了影響,進(jìn)而干擾了DTIC在體內(nèi)的代謝,最終導(dǎo)致DTIC實際利用率下降。此推測需要進(jìn)一步通過實驗去證實[24-27]。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種HPLC方法,在等度洗脫條件下,快速對尿液中DTIC準(zhǔn)確定量。該方法簡便,可靠,線性范圍廣,便于推廣。將該方法成功應(yīng)用于黑色素瘤C57BL/6小鼠不同發(fā)病進(jìn)程尿液中DTIC含量的監(jiān)測。同時結(jié)合小鼠體重和腫瘤體積,對BA聯(lián)合DTIC治療黑色素瘤的效果進(jìn)行了初步評價,發(fā)現(xiàn)BA的攝入會對DTIC利用率產(chǎn)生一定影響。