溴化1-乙烯基-3-十二烷基咪唑硅膠鍵合固定相制備及其色譜性能

李新庭, 梁 鵬, 周玉鳳, 喬曉強(qiáng)

(河北大學(xué)藥學(xué)院, 河北 保定 071002)

高效液相色譜一直在分離分析領(lǐng)域中扮演著重要的作用,憑借高分離效率、良好的選擇性等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為復(fù)雜樣品分離分析中應(yīng)用最廣泛的工具之一[1]。經(jīng)典的反相色譜、親水作用色譜、離子交換色譜、體積排阻色譜等模式的色譜固定相已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析、農(nóng)產(chǎn)品檢測、生物分析和精細(xì)化工分離純化等諸多領(lǐng)域[2-7]。近年來,隨著復(fù)雜樣品分離分析的需求,混合模式色譜固定相材料[8-11]的研究受到了廣泛關(guān)注。與單一模式的色譜固定相材料相比,混合模式色譜固定相具有更好的分辨效率,并可提供優(yōu)異的選擇性。因此,開發(fā)新型的混合模式色譜固定相材料對于滿足日益增加的復(fù)雜樣品分離分析需求具有重要的研究意義。

離子液體作為一種“綠色溶劑”,具有蒸氣壓極低、熱穩(wěn)定性高以及對有機(jī)和無機(jī)物均有良好的溶解性等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成和催化[12]、能源環(huán)境[13]、食品檢測[14,15]、生物檢測[16]等多個領(lǐng)域。基于上述優(yōu)良性能,離子液體已被開發(fā)成新型有機(jī)功能化試劑,用于多種硅膠修飾色譜固定相材料的制備[17-19]。例如,Qiao等[17]制備了新型咪唑嵌和C8硅膠修飾色譜固定相,該固定相顯示典型的反相/親水混和模式保留機(jī)制,并成功實(shí)現(xiàn)了奶粉中三聚氰胺的無干擾分離檢測。Bai等[18]利用N-甲基咪唑改性二氧化硅,制備了N-甲基咪唑修飾硅膠色譜固定相;作者研究發(fā)現(xiàn),該色譜固定相對酸性蛋白質(zhì)分離具有特殊的分離選擇性。

磷脂作為細(xì)胞膜的主要成分,廣泛存在于種子、動物細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)中,在生命活動中扮演著重要的生物作用。例如,心磷脂的異常會造成線粒體功能障礙,進(jìn)一步會引起心血管疾病[20]。目前磷脂的色譜分離普遍采用經(jīng)典的C18反相色譜固定相材料[21,22]。為了應(yīng)對日益增加的實(shí)際樣品分離分析需求,開發(fā)新型的磷脂分離分析材料對于其結(jié)構(gòu)及后續(xù)的生物學(xué)功能研究具有重要意義。含有十二烷基側(cè)鏈的咪唑基離子液體已被證實(shí)對于生物膜中的膜蛋白質(zhì)具有良好的溶解性能[23]?；诖?本文探索將具有潛在生物兼容性的離子液體溴化1-乙烯基-3-十二烷基咪唑(1-vinyl-3-dodecylimidazole bromide, VDI)作為功能單體,通過一步法點(diǎn)擊反應(yīng)將其接枝到巰基功能化硅球表面,制備新型溴化1-乙烯基-3-十二烷基咪唑硅膠鍵合固定相(Sil-VDI),并初步探索其對雞蛋黃磷脂和肺腺癌細(xì)胞提取膜脂的分離效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker Optik公司); TGA/SDTA851E熱重分析儀(美國Perkin-Elmer公司); GLK100型色譜柱裝填系統(tǒng)(無錫加萊克色譜科技有限公司);超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司); P230Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)(大連依利特分析儀器有限公司); ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰科技有限公司)。

球形多孔硅膠(silica, SiO2,粒徑5 μm,孔徑30 nm,富士硅化學(xué)株式會社); (3-巰基丙基)三甲氧基硅烷((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPS, 97%,阿拉丁試劑有限公司); VDI(99%,北京華威銳科化工有限公司);偶氮二異丁腈(2,2-azoisobutyronitrile, AIBN,百靈威科技有限公司);甲苯、氯仿、環(huán)己醇、異丙醇和丙酮(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);乙腈和甲醇(HPLC級,上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?;色譜用純水由法國Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)純化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Sil-VDI色譜固定相材料的制備

如圖1所示,Sil-VDI色譜固定相材料的制備分為兩部分。第一部分為巰基化硅球(Sil-MPS)的制備:首先將30 mL無水甲苯作為反應(yīng)溶劑置于100 mL燒瓶中,然后稱取2.5 g活化后的球形多孔硅膠懸浮于無水甲苯中,迅速加入3 mL的MPS,將其混勻后于110 ℃在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,將其冷卻至室溫,抽濾,依次使用甲苯、甲醇-水和甲醇反復(fù)洗滌,然后將其置于110 ℃真空干燥過夜,得到巰基化硅球。

第二部分為Sil-VDI固定相材料的制備:稱取2.5 g Sil-MPS加入到100 mL燒瓶中,稱取3.75 g VDI溶解于30 mL甲醇中,充分分散均勻,加入到燒瓶中,繼續(xù)加入250 mg的AIBN,使三者充分混勻,于60 ℃在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流攪拌反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)物冷卻到室溫,抽濾,依次用甲醇-水、甲醇反復(fù)洗滌,然后將其置于110 ℃真空干燥過夜,得到Sil-VDI固定相材料。

1.2.2Sil-VDI色譜柱的填充

Sil-VDI色譜柱采用勻漿法裝柱。以氯仿-環(huán)乙醇(8∶12, v/v)為勻漿液,將2.5 g Sil-VDI材料與勻漿液充分混勻分散。將混懸液緩慢置于勻漿管中,以甲醇-異丙醇(1∶1, v/v)為頂替液,調(diào)節(jié)壓力至35 MPa,裝填色譜柱(150 mm×4.6 mm)。保持壓力約30 min,裝填結(jié)束,用甲醇沖洗裝填的Sil-VDI色譜柱,備用。

1.3 樣品制備

1.3.1色譜測試標(biāo)準(zhǔn)品的制備

烷基苯、多環(huán)芳烴、苯胺、苯衍生物溶解在乙腈或者水中,質(zhì)量濃度控制在200～300 mg/L,待充分溶解后離心、過膜、備用。溴酸鉀、硝酸鉀、碘酸鉀溶解在水中,質(zhì)量濃度控制在200～300 mg/L,待充分溶解后離心、過膜、備用。

1.3.2膜脂樣品的制備

肺腺癌細(xì)胞膜脂的提取按照傳統(tǒng)的Folch法[24]。肺腺癌細(xì)胞經(jīng)裂解后,按照質(zhì)量體積比1∶18加入混合溶劑氯仿-甲醇(2∶1, v/v)。充分搖勻后,于3000 r/min離心10 min,繼續(xù)加入0.2倍體積的水,搖勻后,以3000 r/min離心10 min,得到上下兩層液體。將上清液移除,用甲醇-水(1∶1, v/v)沖洗兩個界面之間,得到下層膜脂的溶液。將下層溶液用氮?dú)獯蹈?得到細(xì)胞膜脂樣品,備用。

雞蛋黃磷脂的提取方法[25]:取新鮮雞蛋一枚,將其蛋黃部分分離置于燒杯中,按質(zhì)量比1∶10加入95%(v/v)的乙醇,混合均勻后,移至圓底燒瓶,室溫下磁力攪拌2 h,抽濾,得到乙醇混懸液。重復(fù)加入95%(v/v)的乙醇洗滌殘?jiān)?～3次,抽濾,合并混懸液。將混懸液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮,得到濃縮物,加入丙酮反復(fù)洗滌,直至丙酮洗滌液接近無色,然后將濃縮物用氮?dú)獯蹈?得到蛋黃磷脂樣品,備用。

1.4 色譜分離條件

分離烷基苯、多環(huán)芳烴和苯胺采用乙腈-水為流動相,流速為1.0 mL/min,等度洗脫,紫外檢測波長為254 nm;分離苯衍生物采用乙腈-水為流動相,流速為1.0 mL/min,等度洗脫,紫外檢測波長為214 nm;分離無機(jī)陰離子采用KCl溶液為流動相,流速為1.0 mL/min,等度洗脫,紫外檢測波長為210 nm。

分離膜脂樣品采用甲醇-乙腈-水為流動相,流速為1.0 mL/min,等度洗脫,蒸發(fā)光散射檢測器檢測,其中漂移管溫度為100 ℃,柱溫為室溫,霧化氣壓力350 kPa,載氣流速為2.0 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 Sil-VDI色譜固定相材料的表征

分別采用傅里葉變換紅外光譜儀和熱重分析儀對Sil-VDI固定相材料進(jìn)行了表征。首先采用傅里葉變換紅外光譜儀對SiO2、Sil-MPS和Sil-VDI固定相材料進(jìn)行了表征。如圖2a所示,在SiO2、Sil-MPS和Sil-VDI固定相材料中均出現(xiàn)了1 100 cm-1強(qiáng)吸收峰,該峰由硅球中Si-O伸縮振動吸收引起;在SiO2譜圖出現(xiàn)980 cm-1吸收峰,這是硅醇基的特征吸收峰;當(dāng)連接MPS后,在Sil-MPS譜圖中980 cm-1處吸收峰完全消失,表明MPS成功地修飾到了硅球表面;當(dāng)進(jìn)一步修飾VDI之后,在Sil-VDI固定相材料的譜圖中可以看到在2 930 cm-1和2 840 cm-1出現(xiàn)兩個明顯的特征吸收峰,這是VDI結(jié)構(gòu)中甲基和亞甲基的特征吸收峰。上述結(jié)果可證明VDI成功修飾到了硅球表面。

進(jìn)一步采用熱重分析儀對所制備的Sil-VDI固定相材料進(jìn)行了表征。如圖2b所示,Sil-MPS在400 ℃左右質(zhì)量損失加劇,在600 ℃時,與未修飾SiO2相比,質(zhì)量損失約2%。Sil-VDI固定相材料在200 ℃左右質(zhì)量損失迅速加劇,在600 ℃時,與未修飾的SiO2和Sil-MPS相比,質(zhì)量損失分別為10.5%和8.5%,主要為固定相上鍵合的有機(jī)物部分脫落所致。上述結(jié)果可進(jìn)一步證明Sil-VDI固定相材料已被成功地制備。

圖 3 (a)疏水性物質(zhì)和(b、c)無機(jī)陰離子在Sil-VDI 色譜柱上的保留特征Fig. 3 Retention characteristics of (a) hydrophobic compounds and (b, c) inorganic anions on Sil-VDI column

2.2 Sil-VDI填充色譜柱的保留機(jī)制

首先選取4種疏水性的苯、甲苯、丙苯和丁苯為代表性測試物,對Sil-VDI色譜柱的保留機(jī)制進(jìn)行考察。如圖3a所示,隨著乙腈在流動相中的比例從40%增加到90%, 4種疏水性物質(zhì)的保留在Sil-VDI色譜柱上呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢,符合反相色譜的保留特征。因此,Sil-VDI色譜柱具有典型的反相色譜保留機(jī)制。

2.3 色譜性能的考察

2.3.1分離疏水性物質(zhì)

基于Sil-VDI固定相材料的反相保留特征,首先選取4種烷基苯類物質(zhì)苯、甲苯、丙苯和丁苯,考察了Sil-VDI色譜柱的分離性能。如圖4a所示,采用乙腈-水(45∶55, v/v)作為流動相時,苯、甲苯、丙苯和丁苯4種物質(zhì)可以在7 min內(nèi)達(dá)到基線分離,并且峰形良好,其出峰順序和其疏水性完全一致,再次驗(yàn)證了在分離疏水性物質(zhì)時,Sil-VDI色譜柱具有典型的反相保留機(jī)制。多環(huán)芳烴類物質(zhì)聯(lián)苯、鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯和苯并菲的分離效果如圖4b所示。以乙腈-水(60∶40, v/v)為流動相,7 min以內(nèi)4種物質(zhì)達(dá)到基線分離,且峰形良好。此外,位置異構(gòu)體鄰三聯(lián)苯和間三聯(lián)苯顯示了良好的分離效果,其分離度可達(dá)3.26。對于苯衍生物苯甲醇、苯乙醇、苯甲腈和苯甲醚,所制備的Sil-VDI色譜柱同樣顯示了良好的分離性能。如圖4c所示,采用乙腈-水(18∶82, v/v)為流動相,4種苯衍生物可在6 min內(nèi)達(dá)到基線分離,其分離度分別為2.96、3.68和4.75,拖尾因子在0.95～1.10之間。

最后選取了4種堿性的苯胺(鄰苯二胺、對硝基苯胺、1-萘胺和2-苯胺)測試了Sil-VDI色譜柱的分離能力。如圖4d所示,以乙腈-水(50∶50, v/v)為流動相,在5 min內(nèi)4種堿性苯胺可以實(shí)現(xiàn)基線分離,分離度依次為5.30、2.82和5.33,拖尾因子在1.00～1.28之間。綜上所述,所開發(fā)的Sil-VDI色譜柱在分離多種疏水性物質(zhì)時顯示了良好的潛能。

圖 4 疏水性物質(zhì)(a)烷基苯、(b)多環(huán)芳烴、(c)苯衍生物和(d)苯胺在Sil-VDI色譜柱上的分離色譜圖Fig. 4 Separation chromatograms of hydrophobic (a) alkylbenzenes, (b) polycyclic aromatic hydrocarbons, (c) benzene derivatives, and (d) anilines on Sil-VDI column Mobile phase: a. ACN-H2O (45∶55, v/v); b. ACN-H2O (60∶40, v/v); c. ACN-H2O (18∶82, v/v); d. ACN-H2O (50∶50, v/v).

2.3.2分離無機(jī)陰離子

圖 5 無機(jī)陰離子在Sil-VDI色譜柱上的分離譜圖Fig. 5 Separation chromatogram of inorganic anions on Sil-VDI columnMobile phase: 250 mmol/L KCI, pH=4.1.

2.3.3重現(xiàn)性的考察

進(jìn)一步采用疏水性多環(huán)芳烴類物質(zhì)聯(lián)苯、鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯和苯并菲,考察了Sil-VDI色譜柱的重現(xiàn)性。如圖6所示,以乙腈-水(60∶40, v/v)為流動相,該色譜柱連續(xù)運(yùn)行使用6和12 h后,4種多環(huán)芳烴類物質(zhì)的分離譜型并無明顯變化,其保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.68%,顯示了良好的分離重現(xiàn)性。

圖 6 Sil-VDI色譜柱分離的重現(xiàn)性Fig. 6 Separation reproducibility of the Sil-VDI columnMobile phase: ACN-H2O (60∶40, v/v).

2.3.4在磷脂提取樣品分離中的應(yīng)用

我們進(jìn)一步將Sil-VDI色譜柱用于肺腺癌細(xì)胞和雞蛋黃磷脂提取物的分析,結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測,初步探索了所發(fā)展色譜柱對磷脂樣品的分析效果。首先,以模式樣品磷脂酰乙醇胺測試了色譜柱的性能。以甲醇-乙腈-水(65∶17.5∶17.5, v/v/v)為流動相,PE可在4.5 min左右出峰,且峰形良好(見圖7a)。在相同的色譜條件下,肺腺癌細(xì)胞膜脂提取樣品在Sil-VDI色譜柱中顯示出良好的分離效果,在8 min以內(nèi)可觀測到6個主要色譜峰(見圖7b)。對于雞蛋黃磷脂樣品,以甲醇-乙腈-水(50∶34∶16, v/v/v)為流動相,5 min以內(nèi)同樣可分離出6個主要色譜峰。上述結(jié)果表明,Sil-VDI色譜柱對于磷脂提取樣品同樣展示了一定的分離潛能。后續(xù)研究中會對上述磷脂的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定。

圖 7 (a)磷脂酰乙醇胺、(b)肺腺癌細(xì)胞膜脂和(c)雞蛋黃磷脂在Sil-VDI色譜柱上的分離色譜圖Fig. 7 Separation chromatograms of (a) phosphatidyl- ethanolamine (PE), (b) lung adenocarcinoma lipids, and (c) egg yolk phospholipids on Sil-VDI column Mobile phase: a. CH3OH-ACN-H2O (65∶17.5∶17.5, v/v/v); b. CH3OH-ACN-H2O (65∶17.5∶17.5, v/v/v); c. CH3OH-ACN-H2O (50∶34∶16, v/v/v).

3 結(jié)論

本研究以溴化1-乙烯基-3-十二烷基咪唑?yàn)楣δ軉误w,制備了Sil-VDI色譜固定相并研究了其色譜分離性能。填充的Sil-VDI色譜柱具有典型的反相/離子交換混合模式保留機(jī)制。在反相色譜和離子交換色譜模式下,Sil-VDI色譜柱實(shí)現(xiàn)了烷基苯類物質(zhì)、多環(huán)芳烴類物質(zhì)、苯衍生物和苯胺類物質(zhì)以及無機(jī)陰離子的分離分析,且具有良好的分離重現(xiàn)性。初步探索了Sil-VDI色譜柱對肺腺癌細(xì)胞和雞蛋黃磷脂樣品的分離分析能力,顯示了一定的分離潛能,后續(xù)工作會進(jìn)一步研究該固定相的生物樣品分離性能。