利用谷氨酸棒桿菌CRISPRi系統(tǒng)構(gòu)建L-纈氨酸高產(chǎn)菌株

杜麗紅，熊海波，徐達(dá)，徐慶陽,2，陳寧,2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

谷氨酸棒狀桿菌為一種重要的工業(yè)化生產(chǎn)氨基酸的細(xì)胞工廠[1]，早期谷氨酸棒狀桿菌的修飾得益于隨機(jī)化學(xué)或紫外DNA的突變，雖然得到的菌株可大量積累氨基酸[2-3]，但是性狀不穩(wěn)定和生長(zhǎng)缺陷是菌株常常面臨的問題[4-5]。隨著分子生物學(xué)和全基因組測(cè)序的發(fā)展，基因編輯技術(shù)包括轉(zhuǎn)座子修飾、同源重組、靶點(diǎn)基因的缺失或過表達(dá)[6-8]。但是精準(zhǔn)的基因編輯仍依賴于自殺載體系統(tǒng)，在編輯過程中，需要通過二次重組將載體丟失得到無質(zhì)粒菌株，編輯效率低下是自殺載體系統(tǒng)一直存在的問題[9]。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的流行，依賴于該技術(shù)且應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌的CRISPR-Cpf1技術(shù)得到發(fā)展[10-11]，同時(shí)以pK18mobsacB為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化得到的鏈霉素篩選系統(tǒng)也被提出[12]。

在氨基酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建中，基因缺失是改變胞內(nèi)代謝流向的常用手段[13]，但是生長(zhǎng)缺陷也是基因缺失常見的負(fù)向效應(yīng)之一，因此很難分析并確定這些基因在氨基酸生產(chǎn)中的作用，特別是以維持細(xì)胞正常代謝生長(zhǎng)的中間代謝物為合成前體物的氨基酸。L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的選育經(jīng)歷了傳統(tǒng)誘變到微生物發(fā)酵生產(chǎn)的演變[14-16]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，L-纈氨酸的合成及代謝途徑得到全面深入的研究，谷氨酸棒桿菌中丙酮酸是L-纈氨酸需要的唯一前體物質(zhì)，同時(shí)也是進(jìn)入TCA循環(huán)維持細(xì)胞正常代謝的重要中間代謝物[17]，經(jīng)分子生物學(xué)修飾來保證更多的丙酮酸流向L-纈氨酸合成途徑是細(xì)胞大量積累L-纈氨酸的有效方式[18-20]。同時(shí)L-纈氨酸積累過程中需大量的NADPH來提供還原力[21]，而磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)是為細(xì)胞提供還原力的主要途徑。無論是對(duì)丙酮酸相關(guān)途徑還是對(duì)PPP途徑進(jìn)行修飾，都會(huì)帶來細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的問題，因此L-纈氨酸的高效積累同細(xì)胞生長(zhǎng)之間存在著緊密的聯(lián)系。

為能探究與丙酮酸代謝和PPP途徑相關(guān)的基因在L-纈氨酸生產(chǎn)中的作用，找到利于L-纈氨酸積累的高效修飾靶點(diǎn)，本研究構(gòu)建了一套應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌的雙質(zhì)粒CRISPRi干擾技術(shù)，利用此干擾技術(shù)對(duì)部分基因進(jìn)行不同程度的干擾，以細(xì)胞生長(zhǎng)和L-纈氨酸積累為衡量指標(biāo)，最終確定L-纈氨酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建中重要的修飾靶點(diǎn)，并為促進(jìn)L-纈氨酸積累提供了有效的修飾方向。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 重組菌株的構(gòu)建方法

基因ilvBNXV和pntAB的整合應(yīng)用pK18mobsacB系統(tǒng)，所用重要引物如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 2 Primers used in the study

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

選擇雙酶切技術(shù)將質(zhì)粒線性化，利用PCR技術(shù)獲得目的片段，線性載體和目的片段均得到后，利用同源重組試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，重組體系見表3。

表3 同源重組體系Table 3 The homologous recombination system

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，玉米漿液15 mL/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L，檸檬酸2 g/L，瓊脂粉15 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿液15 mL/L，(NH4)2SO410 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，MnSO42 mg/L，F(xiàn)eSO42 mg/L，VB10.3 mg/L，VH0.2 mg/L，VB120.2 mg/L，苯酚紅2%。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿液20 mL/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO430 mg/L，F(xiàn)eSO430 mg/L，VB10.5 mg/L，VH0.3 mg/L，VB120.2 mg/L，苯酚紅2%。

1.5 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：接種環(huán)刮取保菌管中的菌液1環(huán)并劃線于斜面培養(yǎng)基中，將其放置于32 ℃培養(yǎng)箱中恒溫孵育培養(yǎng)20～24 h。

搖瓶種子培養(yǎng)：用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)基中菌體輕輕刮起，轉(zhuǎn)接于提前滅菌的種子培養(yǎng)基，置于32 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)，200 r/min，培養(yǎng)12～18 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：用提前滅菌的5 mL移液管吸取3 mL種子培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接于提前滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)放于32 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)，200 r/min，培養(yǎng)過程中以苯酚紅為指示劑，通過顏色變化來流加氨水控制pH，發(fā)酵至24 h結(jié)束發(fā)酵。

1.6 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定方法

利用分光光度計(jì)測(cè)定新鮮發(fā)酵液600 nm處的吸光值，并以此來表征發(fā)酵過程中菌體濃度，以O(shè)D600來表示；利用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定發(fā)酵液中目的產(chǎn)品L-纈氨酸濃度。Agilent Cl8(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)為檢測(cè)柱，樣品利用2，4-二硝基氟苯進(jìn)行衍生，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈與50 mmol/L的乙酸鈉水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫配比如表4，柱溫33 ℃，流動(dòng)相流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

表4 二元梯度洗脫表Table 4 A two-element system composed of acetonitrile and sodium acetate

1.7 相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

見參考文獻(xiàn)[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pECXK99E為dcas9的表達(dá)載體，以pXMJ19質(zhì)粒為gRNA的表達(dá)載體，按照1.3中重組質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建兩個(gè)重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖1。

圖1 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of interference plasmids

利用常規(guī)的重組質(zhì)粒構(gòu)建方法成功構(gòu)建了pECXK99E-dcas9。在進(jìn)行pXMJ19-gRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建時(shí)，選擇了3種不同的方案：(1)將pXMJ19進(jìn)行單酶切并線性化，將根據(jù)靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)的20 bp識(shí)別序列分別加在引物的5’端，利用重疊PCR技術(shù)將其加入gRNA構(gòu)件中，再利用同源重組技術(shù)將得到的包括gRNA、回文重疊序列、終止子和tracer RNA的目的片段與線性化質(zhì)粒進(jìn)行重組得到pXMJ19-gRNA質(zhì)粒；(2)將pXMJ19進(jìn)行雙酶切并線性化，同時(shí)將大腸桿菌CRISPRi系統(tǒng)中的酶切位點(diǎn)BSPQI引入目的片段中，將帶有BSPQI酶切位點(diǎn)的目的片段同線性化質(zhì)粒重組，得到不帶有靶點(diǎn)基因識(shí)別序列重組質(zhì)粒后，利用BSPQI酶將該質(zhì)粒線性化，并再次經(jīng)同源重組將靶點(diǎn)基因的識(shí)別序列同線性化質(zhì)粒連接，得到最終的pXMJ19-gRNA質(zhì)粒；(3)雙酶切將質(zhì)粒pXMJ19線性化，將根據(jù)靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)的20 bp識(shí)別序列分別加在引物的5’端，利用重疊PCR將其加入gRNA構(gòu)件中，再利用同源重組將得到的包括gRNA、回文重疊序列、終止子和tracer RNA的目的片段與線性化質(zhì)粒進(jìn)行重組得到質(zhì)粒。3種方案中，方案二理論上為省時(shí)高效的實(shí)施手段，但是在具體操作時(shí)，將3個(gè)方案分別得到的10株轉(zhuǎn)化菌株提取質(zhì)粒送至金唯智公司測(cè)序，發(fā)現(xiàn)方案一和方案二中均沒有成功重組的質(zhì)粒，而方案三中陽性質(zhì)粒的概率為80%，因此在后續(xù)工作中，選擇方案三進(jìn)行pXMJ19-gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建。

2.2 干擾系統(tǒng)的驗(yàn)證

為驗(yàn)證2.1中構(gòu)建的干擾系統(tǒng)是否能夠成功發(fā)揮作用，選擇GFP為報(bào)告基因，并以gfp的非編碼鏈DNA序列為模板，分別在啟動(dòng)子區(qū)域、翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域)和遠(yuǎn)離ATG 200 bp的下游區(qū)域?qū)ふ腋蓴_靶點(diǎn)，構(gòu)建3個(gè)gfp干擾質(zhì)粒，并分別電轉(zhuǎn)入帶有pECXK99E-dcas9的菌株中。將得到的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵進(jìn)行至12 h取樣，測(cè)定不同菌株中GFP的相對(duì)熒光強(qiáng)度，同時(shí)以帶有pECXK99E-dcas9和pXMJ19兩個(gè)質(zhì)粒的菌株為對(duì)照組，結(jié)果如圖2。

通過結(jié)果可以看出，對(duì)gfp不同區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，GFP的相對(duì)熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了明顯的差異。對(duì)gfpDNA序列的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，GFP的相對(duì)熒光強(qiáng)度最低，對(duì)遠(yuǎn)離ATG 200 bp的下游區(qū)域進(jìn)行弱化時(shí)，同未被弱化的GFP差異較小，表明利用本研究中構(gòu)建的雙質(zhì)粒干擾系統(tǒng)對(duì)基因gfp的轉(zhuǎn)錄水平成功進(jìn)行了干擾弱化，且選擇的3個(gè)干擾區(qū)域可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶點(diǎn)基因的不同弱化水平。因此在對(duì)L-纈氨酸相關(guān)途徑進(jìn)行弱化時(shí)，同樣選擇靶基因DNA序列非編碼鏈的啟動(dòng)子區(qū)域、翻譯起始區(qū)域和遠(yuǎn)離ATG 200 bp的下游區(qū)域3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶基因的弱化表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

GP0-對(duì)照菌株; GP1-弱化gfp啟動(dòng)子區(qū)域; GP2-弱化gfp翻譯起始區(qū)域; GP3-弱化gfp遠(yuǎn)離ATG區(qū)域圖2 不同干擾方式對(duì)基因gfp相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of different interference strategies on relative fluorescence intensity of gfp

2.3 L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

L-纈氨酸生物合成途徑中，唯一一個(gè)限速反應(yīng)由乙酸乳酸合酶(AHAS)催化進(jìn)行，但是此酶受到L-纈氨酸的反饋抑制，因此在L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建中，首要任務(wù)是解除L-纈氨酸對(duì)AHAS的反饋抑制并進(jìn)行上調(diào)表達(dá)。為獲得可初步積累L-纈氨酸的菌株，以本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)傳統(tǒng)誘變得到的L-纈氨酸生產(chǎn)菌株XV的基因組DNA為模板，對(duì)已經(jīng)成功解除反饋抑制的AHAS編碼基因ilvBN進(jìn)行擴(kuò)增，利用pK18mobsacB技術(shù)，將Ptuf-ilvBNXV整合至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032pqo位點(diǎn)，得到菌株A01，同時(shí)為進(jìn)一步強(qiáng)化A01積累L-纈氨酸的能力，選擇將基因Ptuf-ilvBNXV雙拷貝至A01的Cgl1890位點(diǎn)，得到菌株A02。對(duì)菌株A01、A02進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032為對(duì)照組，結(jié)果如圖3。

ATCC 13032-對(duì)照菌株; A01-Ptuf-ilvBNXV::pqo; A02-Ptuf-ilvBNXV::pqo Ptuf-ilvBNXV::Cgl1890圖3 不同菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Shaking flask fermentation results of different strains

從圖3可以看出，ilvBNXV的強(qiáng)化表達(dá)，促進(jìn)了L-纈氨酸的初步積累，雙拷貝菌株的L-纈氨酸產(chǎn)量可達(dá)31.2 g/L，較單拷貝菌株的產(chǎn)量提高了近1倍，同時(shí)其他2種支鏈氨基酸L-亮氨酸和L-異亮氨酸的積累濃度很低，因此選擇菌株A02作為可積累L-纈氨酸的基礎(chǔ)菌株，利用CRISPRi系統(tǒng)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的干擾實(shí)驗(yàn)。

2.4 aceE、gltA和kgd的弱化

因丙酮酸是L-纈氨酸合成所需的唯一前體物，因此增強(qiáng)丙酮酸的供應(yīng)是再次提高菌株A02積累L-纈氨酸能力的關(guān)鍵。但是在微生物胞內(nèi)，丙酮酸是重要的中心代謝物之一，其主要去向是經(jīng)乙酰coA進(jìn)入TCA循環(huán)，維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)。此外，丙酮酸是胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性節(jié)點(diǎn)，對(duì)丙酮酸相關(guān)途徑的修飾對(duì)胞內(nèi)代謝有著明顯的影響，因此L-纈氨酸的積累同細(xì)胞生長(zhǎng)之間存在著緊密聯(lián)系。為能在保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)的同時(shí)，將更多的丙酮酸流向L-纈氨酸合成途徑，利用本研究構(gòu)建的雙質(zhì)粒干擾系統(tǒng)對(duì)丙酮酸代謝相關(guān)靶點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行弱化實(shí)驗(yàn)。首先利用電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將pECXK99E-dcas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入菌株A02，得到A03菌株，根據(jù)不同基因的啟動(dòng)子區(qū)域、翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域)和遠(yuǎn)離ATG 200 bp三個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)弱化靶點(diǎn)，構(gòu)建不同的pXMJ19-gRNA質(zhì)粒并分別電轉(zhuǎn)入菌株A03得到不同的菌株后，進(jìn)行了搖瓶實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵進(jìn)行至8 h，添加0.2 mmol/L的IPTG對(duì)干擾質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)L-纈氨酸濃度和靶點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)以帶有pECXK99E-dcas9和pXMJ19質(zhì)粒的菌株A030為對(duì)照組，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，在對(duì)aceE、gltA和kgd三個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行不同區(qū)域干擾弱化時(shí)，3個(gè)靶點(diǎn)基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)了明顯的差異。在對(duì)3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行弱化時(shí)，3個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了明顯的下降，且均低于0.15；對(duì)翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域)進(jìn)行干擾時(shí)，3個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均低于0.5；而對(duì)遠(yuǎn)離ATG區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，3個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均在0.7以上。通過測(cè)定L-纈氨酸濃度發(fā)現(xiàn)，基因aceE的干擾效果對(duì)促進(jìn)L-纈氨酸的積累有著明顯的正向效果，在對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行弱化時(shí)，基因aceE的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平過低，細(xì)胞因TCA循環(huán)受阻出現(xiàn)了生長(zhǎng)緩慢的問題，產(chǎn)量在30.1 g/L，而對(duì)翻譯起始區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，L-纈氨酸的積累濃度達(dá)34.6 g/L，較對(duì)照菌株提高了6.1 g/L，表明對(duì)丙酮酸主要代謝途徑的弱化節(jié)省的部分丙酮酸成功進(jìn)入了L-纈氨酸的合成途徑。但是在對(duì)gltA和kgd進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)L-纈氨酸的積累沒有明顯的促進(jìn)的作用。結(jié)果表明在L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建中，直接決定丙酮酸去向的基因aceE是一個(gè)重要的修飾靶點(diǎn)，而TCA循環(huán)中的相關(guān)基因的弱化不會(huì)帶來明顯的效果。

圖4 不同干擾位點(diǎn)對(duì)菌株A03搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-纈氨酸的影響Fig.4 Effects of different interference sites on L-valine production

2.5 PPP途徑的弱化

除弱化丙酮酸向TCA的代謝以外，通過弱化葡萄糖向PPP途徑的代謝，也可以在一定程度上增加糖酵解途徑的碳源分配進(jìn)而增加流向L-纈氨酸合成途徑的代謝流量。因胞內(nèi)PPP途徑是為細(xì)胞提供還原力的主要途徑，因此在對(duì)PPP途徑進(jìn)行弱化時(shí)首先要解決L-纈氨酸合成所需還原力NADPH供應(yīng)的問題。在對(duì)PPP途徑進(jìn)行弱化前，首先強(qiáng)化了可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)NADH/NADPH需要而實(shí)現(xiàn)兩者相互轉(zhuǎn)化的基因pntAB，并保證該基因受到較強(qiáng)啟動(dòng)子sod的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在基因pntAB得到強(qiáng)化后，對(duì)PPP途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶(Cgl1576編碼)進(jìn)行了干擾弱化，結(jié)果如圖4。對(duì)3個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，基因Cgl1576的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了明顯的差異，對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，雖然靶基因的轉(zhuǎn)錄水平最低，約為正常水平的0.19，但是L-纈氨酸的產(chǎn)量沒有因更多碳源流入EMP途徑而提高；對(duì)翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG附近)進(jìn)行干擾是3組實(shí)驗(yàn)中效果最為明顯的修飾手段，L-纈氨酸濃度可達(dá)32.3 g/L；對(duì)遠(yuǎn)離ATG區(qū)域進(jìn)行弱化時(shí)，L-纈氨酸的濃度沒有明顯提升。結(jié)果表明，對(duì)PPP途徑進(jìn)行弱化來提高EMP途徑的代謝通量也可提高細(xì)胞積累L-纈氨酸的能力。

如表5所示，在對(duì)糖酵解和TCA途徑中多個(gè)基因進(jìn)行修飾時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有對(duì)aceE進(jìn)行弱化時(shí)才會(huì)明顯促進(jìn)L-纈氨酸的積累，而對(duì)基因gltA和kgd的弱化沒有表現(xiàn)出明顯的正向效應(yīng)；對(duì)PPP途徑中Cgl1576的弱化同樣會(huì)促進(jìn)L-纈氨酸的積累。因此，在L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建中，弱化直接決定丙酮酸去向的基因和同糖酵解途徑競(jìng)爭(zhēng)碳源的PPP途徑是有效的修飾手段。

表5 不同修飾靶點(diǎn)對(duì)L-纈氨酸產(chǎn)量的影響Table 5 Effects of different modified targets on L-valine production

2.6 aceE和Cgl1576的同時(shí)弱化

根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無論是對(duì)丙酮酸相關(guān)途徑還是對(duì)PPP途徑的弱化，都起到了明顯效果。為能保證更多的碳源流向糖酵解途徑，同時(shí)糖酵解產(chǎn)物丙酮酸及時(shí)流向L-纈氨酸合成途徑，嘗試同時(shí)對(duì)aceE和Cgl1576的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行干擾弱化。對(duì)aceE的弱化方式選擇對(duì)翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域)的弱化，在此基礎(chǔ)上對(duì)PPP途徑進(jìn)行修飾時(shí)選擇了2.5小節(jié)中對(duì)基因Cgl1576的弱化方式并對(duì)得到的菌株進(jìn)行了驗(yàn)證，在搖瓶培養(yǎng)至16 h時(shí)添加作用濃度為0.2 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，保證弱化質(zhì)粒發(fā)揮作用，32 h結(jié)束發(fā)酵并測(cè)定發(fā)酵液中的L-纈氨酸的濃度。

A0300-對(duì)照菌株; A0301-同時(shí)弱化aceE翻譯起始區(qū)域和Cgl1576啟動(dòng)子區(qū)域; A0302-同時(shí)弱化aceE翻譯起始區(qū)域和Cgl1576翻譯起始區(qū)域; A0303-同時(shí)弱化aceE翻譯起始區(qū)域和Cgl1576遠(yuǎn)離翻譯起始區(qū)域圖5 不同弱化組合方式對(duì)L-纈氨酸積累的影響Fig.5 Effects of different weakening combination on L-valine accumulation

如圖5所示，同時(shí)對(duì)EMP和PPP途徑進(jìn)行修飾來積累更多的丙酮酸，進(jìn)而提高細(xì)胞積累L-纈氨酸的能力取得了明顯的成果，在對(duì)aceE的翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域)弱化的基礎(chǔ)上，對(duì)Cgl1576的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行干擾時(shí)，2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平受到了嚴(yán)重的弱化，維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和為細(xì)胞供能的兩個(gè)代謝途徑也受到了阻礙，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，積累L-纈氨酸的能力也隨之下降；而對(duì)Cgl1576其他2個(gè)區(qū)域的弱化均有利于L-纈氨酸的積累，其中對(duì)翻譯起始區(qū)域弱化得到的菌株A0302是所有實(shí)驗(yàn)組中最具潛力的菌株，可積累L-纈氨酸37.1 g/L。

3 結(jié)論

丙酮酸是L-纈氨酸生物合成所需的唯一前體物，同時(shí)是細(xì)胞內(nèi)重要的剛性節(jié)點(diǎn)，因此在L-纈氨酸大量積累的同時(shí)，維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)是L-纈氨酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建中一直存在的瓶頸。本研究建立了應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌的誘導(dǎo)型CRISPRi技術(shù)并成功應(yīng)用到L-纈氨酸生產(chǎn)領(lǐng)域，不僅保證了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，而且實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶點(diǎn)基因時(shí)空上的靈活調(diào)控。通過對(duì)TCA循環(huán)和PPP途徑中的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控，確定了能明顯促進(jìn)L-纈氨酸積累的關(guān)鍵靶點(diǎn)和弱化方式，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括aceE編碼的丙酮酸脫氫酶亞基E1和由Cgl1576編碼的六磷酸葡萄糖脫氫酶，分別對(duì)兩個(gè)基因的翻譯起始區(qū)域(DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域)進(jìn)行弱化是最佳的調(diào)控方式，得到菌株A03E2和A0362可分別積累L-纈氨酸34.6 g/L和32.3 g/L，較對(duì)照菌株A0300提高了6.1 g/L和3.8 g/L。為能得到更理想的代謝流分配，對(duì)aceE和Cgl1576兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行了弱化實(shí)驗(yàn)，并對(duì)多種不同組合方式進(jìn)行了驗(yàn)證，最終確定同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因的翻譯起始區(qū)域，即DNA序列中起始密碼子ATG區(qū)域，進(jìn)行弱化時(shí)效果顯著，得到的菌株A0302可積累L-纈氨酸37.1 g/L，為所有實(shí)驗(yàn)組中最高的產(chǎn)值。研究中靶點(diǎn)基因的修飾策略為以后L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了思路和方向。