濾泡輔助性T細(xì)胞在重癥肌無力伴胸腺瘤患者胸腺中的表達(dá)

宋陽 葉曉玲 陳佶 朱勇俊 徐朋亮 伍寧 陳剛 苗鋒 巫偉偉 陳志明

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是T細(xì)胞依賴的、乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的發(fā)生于神經(jīng)肌肉接頭處傳遞功能障礙的自身免疫病[1]。80%～90%的MG患者的胸腺有病理學(xué)異常[2]，其中65%～75%有淋巴結(jié)增生的胸腺濾泡和生發(fā)中心增殖[3]，15%～20%的患者伴發(fā)胸腺瘤。胸腺是人體重要的免疫器官，在免疫耐受及T細(xì)胞成熟等方面發(fā)揮重要作用[4-5]。胸腺切除是治療MG的重要方法，多數(shù)患者術(shù)后病情明顯緩解，其確切機(jī)制仍不清楚。

近年研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞亞群之一的濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cells，Tfh）不僅能輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而且是代表淋巴組織中效應(yīng)T細(xì)胞的最大和最重要的亞群[6-7]。Tfh細(xì)胞具有特異性表達(dá)趨化因子受體5（C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5）和可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）、促使濾泡B細(xì)胞歸巢/遷移和輔助B細(xì)胞等顯著特點(diǎn)。Tfh細(xì)胞產(chǎn)生輔助性細(xì)胞因子，如白介素-21（interleukin-21，IL-21)，通過與其受體的作用刺激B淋巴細(xì)胞分化成為產(chǎn)生特異性抗體的漿細(xì)胞。Tfh細(xì)胞功能失調(diào)可能參與免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制[8]。在甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性干燥綜合征和自身免疫性腎病等疾病中，Tfh細(xì)胞數(shù)目、比例以及相應(yīng)蛋白的表達(dá)量均明顯增高[9-12]。

然而，胸腺瘤瘤旁胸腺組織中Tfh細(xì)胞在MG伴胸腺瘤的疾病發(fā)展過程中的作用及其免疫機(jī)制尚不清楚。本研究通過分析MG伴胸腺瘤、無MG胸腺瘤患者瘤旁胸腺組織以及萎縮胸腺組織中Tfh細(xì)胞及其蛋白分子CXCR-5、Bcl-6、ICOS、PD-1的表達(dá)差異，探討MG伴胸腺瘤瘤旁胸腺環(huán)境中Tfh活性程度及其參與MG伴胸腺瘤發(fā)病的免疫機(jī)制。

材料與方法

一、病例和分組

選取2013年1月—2015年4月在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心胸外科診斷為MG伴胸腺瘤、胸腺瘤不伴MG以及接受心臟手術(shù)的住院患者。

1. MG伴胸腺瘤（MG組）：30例，均必須符合以下標(biāo)準(zhǔn)[13]。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合MG診斷標(biāo)準(zhǔn)，即骨骼肌易疲勞，包括咽喉肌和/或延髓肌；②癥狀有波動(dòng)性，伴明顯晨輕暮重特點(diǎn)；③重復(fù)神經(jīng)電刺激顯示低頻（3～5 Hz）刺激時(shí)衰減達(dá)到或超過10%；④膽堿酯酶抑制劑治療有效；⑤18歲<年齡<65歲，男女不限；⑥無任何既往病史；⑥無惡性腫瘤、精神性疾病以及其他嚴(yán)重內(nèi)科疾?。虎吆炇鹬橥鈺?；⑧術(shù)后病理學(xué)檢查確診為胸腺瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3個(gè)月內(nèi)曾使用免疫抑制治療，如糖皮質(zhì)激素或硫唑嘌呤片等；②3個(gè)月內(nèi)曾使用血漿置換術(shù)或靜脈用丙種球蛋白治療；③懷孕或哺乳期；④合并其他自身免疫病或炎性疾；⑤近3個(gè)月參與其他臨床試驗(yàn)。

2. 胸腺瘤不伴MG（NMG組）和心臟手術(shù)（對(duì)照組）：NMG組患者20例，對(duì)照組患者10例。入選條件：①無其他惡性腫瘤、精神疾病以及嚴(yán)重內(nèi)科疾??；②3個(gè)月內(nèi)未使用過激素或者免疫抑制劑；③兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；④簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

PerCP-Cy5.5 標(biāo) 記 的 兔 抗 人CD4 抗 體（Abcam），Alexa Fluor647標(biāo)記的鼠抗人CXCR5抗體（Abcam），兔抗人PD-1抗體（Abcam），兔抗人ICOS抗體（Abcam），兔抗人Bcl-6抗體（Abcam），BCA蛋白定量檢測試劑盒、熒光顯微鏡（USA)。

三、方法

1. 免疫熒光技術(shù)：取切除的胸腺瘤患者瘤旁組織和心臟手術(shù)患者萎縮胸腺組織，常規(guī)制作石蠟切片，免疫熒光染色，觀察胸腺組織中Tfh細(xì)胞及CXCR5和PD-1的表達(dá)情況。采集免疫熒光圖像（×200）輸入至顯微圖像分析儀，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定胸腺Tfh細(xì)胞比例及其細(xì)胞膜上CXCR5和PD-1的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescent intensity，MFI）。

2. 免疫組織化學(xué)法：取切除的胸腺瘤患者瘤旁組織和心臟手術(shù)患者萎縮胸腺組織，常規(guī)制作石蠟標(biāo)本切片，SP法免疫組織化學(xué)染色，觀察胸腺淋巴細(xì)胞ICOS和Bcl-6的表達(dá)水平。細(xì)胞膜被染成棕黃色者為ICOS蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核被染成棕黃色者為Bcl-6蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞。采集免疫組織化學(xué)圖像（×400）輸入至顯微圖像分析儀，利用Image-Pro Plus測定胸腺淋巴細(xì)胞ICOS和Bcl-6染色程度，即平均積分光密度值（mean integrated optical density，MIOD）。

3. 蛋白質(zhì)印跡法：對(duì)胸腺瘤患者瘤旁組織和心臟手術(shù)患者萎縮胸腺組織中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。通過BCA測定法測定蛋白質(zhì)裂解物的濃度。將總計(jì)10 μg的蛋白質(zhì)上樣到12%Tris-甘氨酸凝膠上，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在含0.1%Tween-20和5%牛奶的PBS中封閉2 h，然后在4 ℃下與稀釋的抗體孵育過夜。在37 ℃下加入二抗1 h。測定目的條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值進(jìn)行比較，該比值作為每個(gè)標(biāo)本Tfh細(xì)胞PD-1和Bcl-6蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床資料

3組患者一般資料及胸腺瘤WHO病理分型、Masaoka臨床病理分期和重癥肌無力MGFA分型情況詳見表1。

二、三組胸腺組織中Tfh細(xì)胞比例

免疫熒光結(jié)果顯示：MG組瘤旁組織中Tfh細(xì)胞比例顯著高于NMG組，分別為（20.7±1.1）%和（12.1±1.0）%（P＝0.000 5）（圖1，標(biāo)尺：500 μm）。

三、CXCR5和PD-1表達(dá)的免疫熒光檢測結(jié)果

與N M G 組相比，M G 組瘤旁組織中T f h細(xì)胞C X C R 5 和P D-1 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，分別為0.113±0.008 vs 0.049±0.006（P＜0.000 1）和0.101±0.006 vs 0.041±0.005（P＜0.0001）（圖2，標(biāo)尺為500 μm）。

四、Bcl-6和ICOS表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

與NMG組和對(duì)照組相比，MG組Tfh細(xì)胞Bcl-6表達(dá)明顯增強(qiáng)，分別為0.267±0.024 vs 0.108±0.011（P＜0.000 1）和0.267±0.024 vs 0.077±0.010（P＜0.000 1）；NMG組與對(duì)照組Tfh細(xì)胞Bcl-6表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.094）。與NMG組和對(duì)照組相比，MG組Tfh細(xì)胞ICOS表達(dá)明顯增強(qiáng)，分別為0.174±0.013 vs 0.112±0.008（P＝0.006）和0.174±0.013 vs 0.020±0.003（P＜0.000 1）；NMG組Tfh細(xì)胞ICOS表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.000 1）。各組免疫組織化學(xué)染色情況見圖3（SP法，標(biāo)尺為100 μm）。

表1 三組患者的臨床資料

圖1 CD4+CXCR5+Tさ細(xì)胞在胸腺瘤伴MG患者中高表達(dá)

圖2 Tさ細(xì)胞膜蛋白CXCR5和PD-1在MG伴胸腺瘤中高表達(dá)

圖3 胸腺組織中Tさ細(xì)胞蛋白分子Bcl-6和COS的表達(dá)差異

五、Bcl-6和PD-1蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡法檢測（圖4）結(jié)果顯示：M G組、NMG組和對(duì)照組Tfh細(xì)胞Bcl-6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.731±0.036、0.54±0.048和0.52±0.046，P D-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.8 0 7±0.0 4 0、0.613±0.067和0.495±0.047。以上結(jié)果表明：MG組Tfh細(xì)胞Bcl-6蛋白表達(dá)水平顯著高于NMG組和對(duì)照組（P＝0.036，P＝0.003），該結(jié)果與免疫組織化學(xué)的檢測結(jié)果一致；MG組Tfh細(xì)胞PD-1蛋白表達(dá)水平顯著高于NMG組和對(duì)照組（P＝0.022 7，P＜0.000 1）。NMG與對(duì)照組Tfh細(xì)胞Bcl-6和P D-1 蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.616，P＝0.163）。

圖 4 Bcl-6和PD-1蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

討 論

Tfh細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞型，因其細(xì)胞膜上高表達(dá)CXCR5分子，所以將其定義為CD4+CXCR5+T細(xì)胞[13]。到目前為止，尚未有研究證明胸腺瘤瘤旁胸腺環(huán)境中Tfh細(xì)胞及其CXCR5、Bcl-6、ICOS、PD-1是否參與MG伴胸腺瘤疾病的病理過程。因而，本研究收集胸腺瘤伴MG和不伴MG患者胸腺瘤組織標(biāo)本和心臟手術(shù)患者萎縮胸腺標(biāo)本，通過免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)和蛋白印跡方法檢測胸腺瘤瘤旁胸腺環(huán)境中Tfh細(xì)胞及其蛋白表達(dá)水平，探討Tfh細(xì)胞是否通過不同的免疫反應(yīng)途徑參與MG的發(fā)病過程。

Tfh細(xì)胞能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞通過異常途徑活化，并產(chǎn)生自身免疫性抗體，從而參與自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展。有研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞及其蛋白分子的表達(dá)量在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、IgA腎病、乙型肝炎等患者外周血中明顯高于其相應(yīng)對(duì)照組。MG患者外周血中的Tfh細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組，并且Tfh細(xì)胞與血清中乙酰膽堿受體抗體（AChR-Ab）水平呈正相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MG組的瘤旁胸腺組織中，Tfh細(xì)胞比例較NMG組和對(duì)照組明顯增高，Tfh細(xì)胞可能通過異?；罨岣咦陨砻庖呋钚裕瑥亩o助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自身免疫性抗體，參與MG的進(jìn)展。

Bcl-6是Tfh細(xì)胞表達(dá)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)錄蛋白分子，它能夠促進(jìn)生發(fā)中心Tfh細(xì)胞的活化及B淋巴細(xì)胞的成熟[17]，其表達(dá)量增加不僅促使B淋巴細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的結(jié)合[18]，還可誘導(dǎo)CXCR5的產(chǎn)生[19]。Bcl-6在一定程度上抑制小分子RNA，從而促進(jìn)Tfh細(xì)胞表型所需的表面分子CXCR5、PD-1的表達(dá)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG組患者瘤旁胸腺組織Bcl-6表達(dá)水平較NMG組和對(duì)照組明顯增高。這些數(shù)據(jù)表明，瘤旁胸腺組織中Tfh細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的Bcl-6可能參與MG的發(fā)展，但在MG的發(fā)病機(jī)制中Bcl-6特定角色還有待闡述。

ICOS是Tfh細(xì)胞膜表面高表達(dá)的共刺激蛋白分子，通過與B淋巴細(xì)胞表面的配體結(jié)合，在T細(xì)胞依賴的B淋巴細(xì)胞成熟過程中起重要作用[21-22]。最近研究發(fā)現(xiàn)，ICOS及其受體提供早期信號(hào)誘導(dǎo)Bcl-6的產(chǎn)生而促進(jìn)CXCR5的表達(dá)；ICOS表達(dá)減少或者缺失也會(huì)引起CXCR5水平明顯下降，其在Tfh細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮重要作用[21]。另外，ICOS表達(dá)減少或者缺失將導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)Bcl-6明顯減少，雖然CD4+T細(xì)胞活化和增殖不受影響，但是無法分化為正常的Tfh細(xì)胞。本研究結(jié)果證明，MG組瘤旁胸腺中ICOS表達(dá)水平明顯高于NMG組和對(duì)照組，而NMG組瘤旁胸腺中ICOS表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，說明ICOS在MG伴胸腺瘤中表達(dá)增加并參與疾病過程。

PD-1是近年來被發(fā)現(xiàn)的Tfh細(xì)胞高表達(dá)的標(biāo)志蛋白分子，它可能調(diào)節(jié)生發(fā)中心的形成，并且是Tfh細(xì)胞向B淋巴細(xì)胞提供的直接誘導(dǎo)信號(hào)[23]。PD-1及其配體PD-L1和PD-L2在調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮重要作用。PD-1蛋白分子在Tfh細(xì)胞高表達(dá)，它通過與B淋巴細(xì)胞表達(dá)的PD-L2相互作用，調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞和漿細(xì)胞的數(shù)量及功能：PD-1表達(dá)量增加可抑制Tfh細(xì)胞的功能，維持濾泡性B細(xì)胞產(chǎn)生IL-21；其表達(dá)量下降雖然可增加Tfh細(xì)胞的數(shù)量，但同時(shí)由于減少了重要細(xì)胞因子的合成而導(dǎo)致Tfh細(xì)胞部分功能受損[23]。在攜帶單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）患者體內(nèi)使用低劑量的PD-L1刺激T細(xì)胞，結(jié)果產(chǎn)生了功能缺陷的PD-1介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制反應(yīng)[24]。最近研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)期的患者及其親屬外周血PD-1的表達(dá)量明顯降低，為SLE患者體內(nèi)PD-1的重要抑制功能提供了直接的證據(jù)[25]。另有研究表明，與正常對(duì)照組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞膜上PD-1蛋白表達(dá)水平明顯降低[11]。然而，部分研究并未發(fā)現(xiàn)PD-1抑制Tfh細(xì)胞的功能，但是證實(shí)了PD-1信號(hào)通路通過維持Tfh細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞間的平衡而調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生，PD-1信號(hào)通路減少使得T淋巴細(xì)胞反應(yīng)無法控制，最終導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生[22]。然而，在本研究中，MG組胸腺中PD-1表達(dá)水平明顯高于NMG組和對(duì)照組，PD-1增高可能是PD-1信號(hào)通路出現(xiàn)異常的結(jié)果，從而影響了Tfh細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞間的平衡而參與MG的病理過程。

綜上所述，伴MG的胸腺瘤患者瘤旁胸腺組織中蛋白表達(dá)量較不伴MG的胸腺瘤患者明顯增加，推測胸腺瘤瘤旁胸腺環(huán)境中Tfh細(xì)胞或者其細(xì)胞亞型可能通過上調(diào)自身的免疫活性，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體而參與MG的發(fā)生和進(jìn)展。因此，對(duì)CD4+CXCR5+T細(xì)胞及其細(xì)胞亞型、活化B淋巴細(xì)胞的檢測，不僅有助于評(píng)估患者免疫狀態(tài)，亦有助于進(jìn)一步闡明MG伴胸腺瘤組織中和外周血中的Tfh細(xì)胞之間的功能差異，認(rèn)識(shí)它們與MG的臨床評(píng)分之間的相關(guān)性，以及導(dǎo)致Tfh細(xì)胞升高和發(fā)生免疫失衡的原因和機(jī)制。