LncRNA-XIST/miR-137/Notch1在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清和玻璃體中的表達(dá)及機(jī)制

許瑤 婁靜 趙峰

1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科（江蘇蘇州215000）；2蘇州市獨(dú)墅湖醫(yī)院眼科（江蘇蘇州215000）；3中山大學(xué)中山眼科中心（廣州510060）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一種血管并發(fā)癥，糖尿病通過破壞包含血視網(wǎng)膜屏障（BRB）的內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）之間的緊密連接，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管重塑異常新生血管形成［1］。研究表明，高血糖可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成［2］。因此，調(diào)節(jié)ECs 功能可能為DR 的治療提供一種新的治療策略。

在DR 病變中，NOTCH1 信號紊亂導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障被破壞，因此，NOTCH1 在維持健康視網(wǎng)膜屏障功能中的重要作用［3］。有研究表明miR-137啟動子甲基化在DR 的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要作用［4］。抑制miR-137 基因表達(dá)可減弱高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用［5］。研究表明長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNAs）與2 型糖尿病及其相關(guān)的腎和視網(wǎng)膜并發(fā)癥相關(guān)［6-7］。也有研究表明在糖尿病和糖尿病相關(guān)微血管并發(fā)癥中l(wèi)ncRNAs 存在異常表達(dá)［8-9］。長鏈非編碼RNA XIST（lncRNA-XIST）是位于X 染色體失活中心的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)失調(diào)會與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［10］，但在DR 中的研究尚無報道，這也是本研究的重要目的。

本文通過研究lncRNA-XIST/miR-137/Notch1在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清和玻璃體中的表達(dá)。探討lncRNA-XIST 可能在調(diào)節(jié)全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)和DR 發(fā)展中發(fā)揮重要作用及其可能的機(jī)制，為DR 的治療提供一種新的診療策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料本文收集了我院糖尿病視網(wǎng)膜病變患者（n=12），作為試驗組。對照組分為正常玻璃體對照組（n= 12）和正常血清對照組（n= 12）。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）購于American Type Culture Collection（ATCC），HRMECs 在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Endothelial medium，ECM）中與5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充劑和1%青霉素/鏈霉素溶液在37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)。lncRNA-XIST、silncRNA-XIST、miR-137、silncRNA-XIST 和negative 使 用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染HRMECs。轉(zhuǎn)染48 h 后，用30 mmol/L 葡萄糖作為高糖模型，備用。

1.3 RNA 提取與qRT-PCR總RNA 用lncRNA和miRNeasy 小試劑盒（中國北京天根生物科技公司）提取。用cDNA 合成試劑盒（中國北京天根生物科技公司）反向轉(zhuǎn)錄，用帶有g(shù)DNA 橡皮擦的PrimeScript RT 試劑盒（Takara，Kusatsu，Japan）反向轉(zhuǎn)錄RNA，并用TB-Green 預(yù)混物Ex-Taq-II（Takara）進(jìn)行擴(kuò)增。分別用U6（天根生物科技）為lncRNA和miRNeasy 的內(nèi)對照。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)后72 ℃充分延伸10 min，用2-△△Ct法分析定量結(jié)果。實驗中l(wèi)ncRNA-XIST 上游引物為“CGGGTCT CTTCAAGGACATTTAGCC”，下游引物為“GCACCAATACA GAGGAATGGAGGG”；miR-137 上游引物為“GAA ATC CGA CAG CTT AAG GAG GTT TGA”，下游引物為“CAT TGC ACA GAT AGG ATT TGA TTT ACT”。

1.4 Western blot試驗組、正常玻璃體對照組和正常血清對照組三組中樣品用蛋白質(zhì)提取試劑盒（Qiagen）提取蛋白質(zhì)后BCA 法檢測蛋白濃度。上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，120 V 電泳1 h，電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（100 V 1 h），封閉液中室溫孵育1 h。使用主要抗體包括多克隆anti-Notch1 抗體（1 000∶1）和anti-GAPDH 抗體（1 000∶1）在4 ℃條件下孵育過夜后，TBST 洗膜3 次，使用抗兔二抗IgG 在37 ℃條件下孵育2 h。用ECL 增強(qiáng)化學(xué)熒光試劑（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）和ChemiDoc XRS 系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）觀察表達(dá)，Image J 圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞增殖實驗驗和ELISA 實驗細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）用于檢測細(xì)胞增殖。分別被lncRNA-XIST、silncRNA-XIST、miR-137、silncRNAXIST 和negative 轉(zhuǎn)染后的HRMECs 細(xì)胞按照1 ×105個/mL 鋪在96 孔板上，待每孔細(xì)胞密度生長至70% ～80%后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃孵育4 h 后，在450 nm 處測定吸光度值。按照ELISA 試劑盒的使用步驟檢測ROS、GSH、GSH-px、SOD 和MDA 水平，在450 nm 處測定吸光度值。ROS 染色用DM5000B顯微鏡（Leica biosystems，Wetzlar，德國）觀察細(xì)胞。

1.6 熒光素酶報告分析法將含有野生型或突變型miR-20b-5p 結(jié)合位點(diǎn)的BAMBI 序列3′UTR 插入pmiR-RB 報告載體（ribbio）的XhoI 和NotI 限制位點(diǎn)。將含有野生型或突變型miR-20b-5p 結(jié)合位點(diǎn)的circDNMT3B 序列插入psi-CHECK2 載體（Geneseed）的SgfI 和NotI 限制位點(diǎn)。pmiR-RB 報告和psiCHECK2 向量的地圖如補(bǔ)充圖S1 所示。使用Lipofectamine 3000（生命技術(shù)）將熒光素酶報告載體與miR-20b-5p 模擬物或miR 模擬物NC 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)制造商的說明，使用Synergy H4 多模式閱讀器（BioTek，Winooski，VT，USA）使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）檢測熒光素酶活性。miRNA 在RNA 序列上的結(jié)合導(dǎo)致腎素?zé)晒馑孛福≧luc）表達(dá)降低，影響熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 軟件7.0 版進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗比較兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異。采用單因素方差分析和Bonferroni 多重比較進(jìn)行多重比較。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。每個分析至少進(jìn)行3 個獨(dú)立實驗。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-XIST/miR-137 在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清和玻璃體中的表達(dá)在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中，血清和玻璃體中l(wèi)ncRNA-XIST的表達(dá)量明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1A、1B）。同時，在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中，血清和玻璃體中miR-137 的表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1C、1D）。

圖1 lncRNA-XIST/miR-137 在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清和玻璃體中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA-XIST/miR-137 in serum and vitreous of patients with diabetic retinopathy

2.2 lncRNA-XIST 通過ROS 水平調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖見圖2A，lncRNA-XIST 質(zhì)粒提高視網(wǎng)膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-XIST 的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。lncRNA-XIST 表達(dá)的提高能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖，減少ROS 和MDA 的水平，增加GSH、GSH-PX 和SOD 水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B-G）。silncRNA-XIST 抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-XIST 表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2H。下調(diào)lncRNAXIST 發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖被抑制，ROS 和MDA的表達(dá)水平提高，GSH、GSH-PX 和SOD 的表達(dá)水平受到抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1I-N）。

2.3 miR-137 是lncRNA-XIST 重要靶點(diǎn)見圖3A，miR-137 與lncRNA-XIST 結(jié)合位點(diǎn)。miR-137+lncRNA-XIST 減少熒光素酶表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。提高lncRNA-XIST 表達(dá)水平抑制了視網(wǎng)膜細(xì)胞的miR-137 表達(dá)量，下調(diào)lncRNA-XIST 后下調(diào)視網(wǎng)膜細(xì)胞中miR-137 的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3C、D）。

2.4 miR-137 通過ROS 水平調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖見圖4A，miR-137 質(zhì)粒激活視網(wǎng)膜細(xì)胞中miR-137 表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上調(diào)miR-137 抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖，提高了ROS 和MDA 的水平，減少GSH、GSH-PX 和SOD 水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4B、G）。見圖4H，si-miR-137 中miR-137 的表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。si-miR-137 組中，視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖能力得到增強(qiáng)，ROS 和MDA 的水平受到抑制，GSH、GSH-PX 和SOD 水平也被激活，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4I、N）。

2.5 Notch1 是miR-137 重要靶點(diǎn)見圖5A，Notch1 與miR-137結(jié)合位點(diǎn)。miR-137+ Notch1 減少熒光素酶表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5B）。激活lncRNA-XIST 提高了視網(wǎng)膜細(xì)胞的Notch1 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)lncRNA-XIST 降低了視網(wǎng)膜細(xì)胞的Notch1 蛋白表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5C、D）。同時，上調(diào)miR-137 抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的Notch1 蛋白表達(dá)量，下調(diào)miR-137 后視網(wǎng)膜細(xì)胞的Notch1 蛋白表達(dá)量得到提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5E、F）。

圖2 LncRNA-XIST 通過ROS 水平調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖Fig.2 LncRNA-XIST regulates retinal cell proliferation through ROS levels

圖3 miR-137 是LncRNA-XIST 重要靶點(diǎn)Fig.3 miR-137 is an important target of LncRNA-XIST

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變主要由長期有害的高糖暴露引起，導(dǎo)致血管通透性增加、血管管破壞和血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）破裂［11］。ECs 具有緊密的連接是維持內(nèi)部BRB 的必要條件，其損傷導(dǎo)致血管通透性增加［12］。本研究DR 患者中，lncRNAXIST 表達(dá)被抑制，miR-137 表達(dá)被激活。激活lncRNA-XIST 能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖，減少了ROS 和MDA 的水平，增加GSH、GSH-PX 和SOD 水平。表明，lncRNA-XIST 可以調(diào)控ROS 誘導(dǎo)DR 氧化應(yīng)激損傷。

圖4 miR-137 通過ROS 水平調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖Fig.4 miR-137 regulates retinal cell proliferation by ROS levels

圖5 Notch1 是miR-137 重要靶點(diǎn)Fig.5 Notch1 is the important target of miR-137

研究表明lncRNA-MEG3 的高表達(dá)可通過抑制TGF-β1 和VEGF 的表達(dá)而抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展［13］。也有研究表明lncRNA HOTTIP 通過p38 MAPK 途徑改善糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變，LncRNA HOTTIP 有望成為治療糖尿病微血管病變的新靶點(diǎn)［14-15］。本研究中提高lncRNA-XIST 表達(dá)水平抑制了視網(wǎng)膜細(xì)胞的miR-137 表達(dá)量，下調(diào)lncRNA-XIST 后下調(diào)視網(wǎng)膜細(xì)胞中miR-137 的表達(dá)水平明顯升高，提示miR-137 是lncRNA-XIST 調(diào)控DR 的重要靶點(diǎn)。這與已有研究中在糖尿病條件下，下調(diào)的長非編碼核旁蛋白組裝轉(zhuǎn)錄本1 通過升高miR-497 降低腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)Müller 細(xì)胞凋亡，加重糖尿病視網(wǎng)膜病變的結(jié)果相似［16］。

研究發(fā)現(xiàn)miR-137 過表達(dá)可使ECs 增殖活性顯著降低，高糖環(huán)境下增殖活性進(jìn)一步降低，說明miR-137 過表達(dá)可調(diào)節(jié)ECs 的生物學(xué)功能，降低增殖活性和遷移能力［17-18］。本次研究表明，激活miR-137 能夠抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖，提高了ROS和MDA 的水平，減少GSH、GSH-PX 和SOD 水平。這顯示，lncRNA-XIST/miR-137 可能調(diào)控DR 疾病中ROS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。抑制Notch1 信號觸發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致最后細(xì)胞死亡，進(jìn)一步損害組織活動［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)Notch1 能夠通抑制ROS水平，減少視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞死亡，可保護(hù)DR［21］。本研究發(fā)現(xiàn)激活lncRNA-XIST 能夠激活視網(wǎng)膜細(xì)胞的Notch1 蛋白表達(dá)量。說明，LncRNA-XIST/miR-137/Notch1 在DR 病變患者血清和玻璃體中發(fā)揮著重要作用。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA-XIST/miR-137/Notch1 可能通過ROS 水平及其氧化應(yīng)激來參與糖尿病視網(wǎng)膜病變，具有潛在治療和診斷靶點(diǎn)，為以后的相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。然而本研究中的獲取的樣本量較少，后續(xù)研究中，筆者嘗試對LncRNA-XIST/miR-137/Notch1 參與糖尿病視網(wǎng)膜病變做深入探究，了解LncRNA-XIST/miR-137對糖尿病視網(wǎng)膜病變的調(diào)控是否涉及其他通路。