硫酸右旋糖苷通過下調血管內皮生長因子/血管內皮生長因子受體2表達和M2型巨噬細胞浸潤抑制胃癌血管生成的研究

郭嘉欣 李夢琪 尚靜 焦龍杏 侯紹章 徐遠義 黃允寧

1寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系（銀川750000）；2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科（銀川750000）

胃癌患者死亡的主要原因是發(fā)生復發(fā)和轉移，腹腔種植轉移是主要形式以及決定預后的主要因素，腹膜是常見的轉移部位［1］。胃癌轉移到腹腔形成轉移灶的過程中，血管生成對微轉移灶快速增長至關重要［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃癌腫瘤微環(huán)境中M2 型巨噬細胞與腫瘤血管生成關系密切，M2 型巨噬細胞通過與血管內皮細胞直接接觸或分泌因子促進血管新生［3］。目前對胃癌腹腔轉移患者的治療以全身化療和腹腔灌注化療為主，但仍缺乏療效顯著的治療方案。因此研究組合靶向腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細胞及腫瘤血管生成的抗胃癌腹腔種植轉移藥物具有重要的研究潛力和價值。

硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一種大分子聚陰離子多糖，分子量為500 000 Da，具有來源廣、成本低、易溶性、腹腔吸收慢、毒副作用小的特點，是一種具有腹腔給藥優(yōu)勢的藥物［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DS 可以有效抑制人胃癌細胞的增殖、侵襲遷移和上皮間質轉化［5-7］。但DS 是否能影響胃癌微環(huán)境中M2 型巨噬細胞以及血管內皮生長因子（VEGF）/血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）的表達進而發(fā)揮抗血管生成作用尚不清楚。本實驗先通過免疫組織化學和免疫熒光雙染分析人胃癌組織中M2 型巨噬細胞和腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的關系，再通過動物體內實驗研究DS 對M2 型巨噬細胞浸潤、胃癌血管生成和VEGF/VEGFR2 表達的影響，以期為DS 抑制胃癌血管生成提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌標本收集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2018年12月至2019年10月經手術切除、術后病理確診為胃癌的組織標本34 例，對應癌旁組織標本12 例，所有患者術前均未接受放化療治療，不伴有其他惡性腫瘤。

1.1.2 細胞人胃癌細胞BGC-823 購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.3 動物實驗動物選用購自北京維通利華公司的BALB/c Nude 裸鼠，5 ～7 周齡、雄性、體質量17 ～19 g。動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。裸鼠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心SPF 級屏障環(huán)境內。本研究已通過寧夏醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查委員會批準。

1.1.4 試劑DS（D8906）購于sigma 公司；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自凱基生物有限公司；DAPI、山羊血清購自北京中杉金橋公司；GAPDH、HIF-1α、VEGFR2抗體均購自Proteintech生物公司；CD34和CD163抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人胃癌細胞BGC-823 培養(yǎng)于含有1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞融合至85%～90%時傳代。

1.2.2 藥品配制取0.3 g DS 溶解于99.7 mL 生理鹽水中，形成濃度為0.3%的DS 溶液，用0.22 μm 的過濾器過濾滅菌，用于動物實驗。

1.2.3 動物模型建立及分組實驗前收集對數(shù)生長期的BGC-823 細胞，用生理鹽水調整細胞密度為5 × 107個/mL 待用。裸鼠共24 只，麻醉后腹部消毒，在劍突下開2 mm 切口，將0.2 mL（1 × 107個細胞）的細胞懸液接種于裸鼠腹腔，縫合切口并揉腹使細胞懸液均勻分布。第二天將裸鼠隨機分為DS 組和對照組各12 只，分別向裸鼠腹腔注射0.3%DS 或生理鹽水1 mL。于14 d 后處死裸鼠并取出腹腔轉移瘤組織，每只裸鼠的組織分為兩份，分別放于4%多聚甲醛或-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 免疫組織化學及免疫熒光組織經4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋，切取4 μm 厚切片。按照免疫組織化學或者免疫熒光雙染實驗說明進行染色，顯微鏡下觀察采圖，使用Image-Pro Plus 6.0 分析并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。MVD 統(tǒng)計按照Weidner校正方法，每個標本先在低倍鏡（×200）下選取微血管密度高的區(qū)域即“熱點”，在每個“熱點”中計數(shù)5 個高倍鏡（× 400）視野下的微血管數(shù)，取其平均值為MVD 值。CD163 免疫組化統(tǒng)計，在低倍鏡（×200）下觀察切片，計數(shù)5 個高倍鏡（×400）視野下的陽性細胞數(shù)，取其平均值為CD163 陽性細胞數(shù)。

1.2.5 Western blot將保存于-80 ℃的裸鼠組織切取適量，加入配置好的全蛋白裂解液，研磨勻漿，離心后取上清液，配置成50 μg/10 μL 的蛋白上樣品。將10 μL 蛋白上樣品于10%的SDS-PAGE 電泳，之后濕轉60 min 于PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，相應抗體4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 顯影液曝光存圖。使用Image J 軟件對條帶進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法各獨立實驗均重復3 次，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)用（±s）表示，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗法，CD163陽性細胞和MVD 兩者之間采用Pearson 相關性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人胃癌及癌旁組織中M2 型巨噬細胞與MVD的表達情況及相關性免疫組織化學結果顯示，CD163 主要表達于M2 型巨噬細胞的胞膜，M2 型巨噬細胞為橢圓形有突起棕黃色細胞（圖1A）；CD34主要表達于血管內皮細胞的胞膜和胞質，腫瘤微血管表現(xiàn)為形狀不規(guī)則且排列紊亂（圖1C）。統(tǒng)計結果顯示，胃癌組織中M2 型巨噬細胞和MVD 的表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004、0.001，圖1C、D）。Pearson 相關性分析表明，胃癌組織中M2 型巨噬細胞浸潤數(shù)量與MVD 呈正相關（r=0.701 3，P＜0.000 1，圖1E）。

圖1 免疫組化檢測人胃癌及癌旁組織中CD163 和CD34 表達情況（×200、×400）Fig.1 Immunohistochemistry was used to detect the expression of CD163 and CD34 in gastric cancer and para-carcinoma tissues（×200、×400）

2.2 人胃癌及癌旁組織中M2 型巨噬細胞和微血管分布關系免疫熒光雙染結果顯示（圖2），M2型巨噬細胞是帶有藍色細胞核的紅色標記細胞，腫瘤內血管是綠色熒光標記的管腔樣結構，M2 型巨噬細胞和腫瘤微血管均定位于腫瘤間質，并且M2 型巨噬細胞多浸潤在血管周圍，胃癌組織中M2 型巨噬細胞和微血管數(shù)量明顯高于癌旁組織。

2.3 DS 對裸鼠腹腔種植轉移瘤的影響裸鼠腹腔注射人胃癌細胞BGC-823 14 d 后，可見裸鼠腹腔多發(fā)轉移瘤，多轉移在大網膜、腸系膜和肝臟，為灰白色硬質結節(jié)，提示裸鼠腹腔種植轉移腫瘤模型構建成功。肉眼可見DS 組腫瘤體積和數(shù)量明顯低于對照組（圖3），統(tǒng)計結果顯示DS組腹腔腫瘤結節(jié)數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.014）。

圖2 免疫熒光檢測人胃癌及癌旁組織CD163 和CD34（×400）Fig.2 Immunofluorescence assay was used to detect the expression of CD163 and CD34 in gastric cancer and para-carcinoma tissues（×400）

圖3 DS 組和對照組裸鼠腹腔種植轉移瘤形成情況Fig.3 Abdominal metastasistumor formation of nude mice in DS group and control group

2.4 DS 對裸鼠胃癌腹腔種植轉移瘤中M2 型巨噬細胞浸潤和MVD 的影響免疫組織化學結果顯示，M2 型巨噬細胞定位于轉移瘤組織周圍，微血管定位于轉移瘤組織中，DS 組裸鼠M2 型巨噬細胞浸潤程度（圖4A）和MVD（圖4B）明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.5 DS 對裸鼠胃癌細胞肝臟轉移瘤中CD163、VEGF、VEGFR2 表達的影響Western blot 檢測肝臟轉移瘤CD163、VEGF和VEGFR2蛋白的表達水平（圖5）。結果顯示，與對照組比較，DS組的VEGFR2、CD163、VEGF 的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.037、0.002、0.001）。

圖4 免疫組化檢測DS 組和對照組CD163 和CD34 的表達情況（×400）Fig.4 Immunohistochemistry was used to detect the expressionof CD163 and CD34 in DS groupand control group（×400）

圖5 Western blot 檢測DS 組和對照組CD163、VEGF、VEGFR2 蛋白表達情況Fig.5 Western blot was used to detect the expression of CD163，VEGF and VEGFR2 in DS group and control group

3 討論

胃癌患者死亡的主要原因是發(fā)生轉移，轉移涉及癌細胞過度增殖、侵襲和轉移及血管生成等一系列生物學行為，其中新生血管的生成為腫瘤細胞提供營養(yǎng)及氧氣，是轉移灶形成的必要條件［5］。抑制腫瘤轉移灶中血管生成是抑制轉移的有潛力策略［8］。腫瘤微環(huán)境是腫瘤血管生成的場所，其中M2 型巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境中含量最豐富的免疫細胞，能夠刺激腫瘤血管生成，其浸潤程度與微血管密度有密切關系［9-10］。本研究的人胃癌組織標本的免疫組化和免疫熒光雙染結果表明，胃癌組織中M2 型巨噬細胞浸潤數(shù)量與MVD顯著高于癌旁組織，這與SAMMARCO 等［3］之前的報道一致。并且M2 型巨噬細胞多浸潤在血管周圍，二者數(shù)量上呈正相關。有報道稱M2 型巨噬細胞浸潤程度高的胃癌患者發(fā)生轉移的情況更常見［11］。有研究表明不同TNM 分期患者的MVD 差異有統(tǒng)計學意義，MVD 高的患者臨床轉移發(fā)生率較高［12］。因此將M2 型巨噬細胞與血管生成相關因子作為靶點抑制胃癌組織血管生成，進而抑制轉移瘤形成。

胃癌發(fā)生腹腔和腹膜轉移時，患者對化療的敏感性降低，其中一個原因是血液-腹膜屏障阻止藥物進入腹膜層［13］，并且腫瘤內微血管通常管腔狹窄、彎曲畸形、排列紊亂，因而降低了藥物療效［14］。腹腔給藥的優(yōu)點是使抗癌藥物能夠在腹腔內達到高濃度，并使抗癌藥物可以直接接觸腹膜內游離癌細胞，從而提高治療效果，其中影響腹腔給藥療效的幾個重要藥物特性分別是抗腫瘤活性、分子量大、易溶性及易離子化、腹腔吸收慢和刺激性?。?5］。近年來對腫瘤免疫的研究使人們對免疫細胞間與腫瘤細胞的相互作用有了更深的認識，組合帶有免疫檢查點阻滯劑的抗血管生成藥物已成為抗腫瘤研究熱點［16］。DS 正是這樣一種有潛力的藥物，筆者前期對腹腔使用DS 的裸鼠肝腎功能進行檢測發(fā)現(xiàn)，DS 對肝腎功能無影響，本研究發(fā)現(xiàn)DS 可以抑制腫瘤組織中免疫細胞M2 型巨噬細胞的浸潤并降低微血管密度。

本研究的動物實驗表明，應用DS 的裸鼠腹腔轉移瘤的體積和數(shù)量明顯減少，鏡下可見DS 組腫瘤細胞排列比對照組更為疏松，細胞核固縮甚至碎裂，組織出現(xiàn)明顯壞死。此外，免疫組化結果顯示DS 組轉移瘤組織周圍M2 型巨噬細胞浸潤和血管數(shù)量明顯減少，說明DS 可以減少腫瘤組織周圍M2 型巨噬細胞浸潤和血管的新生，從而抑制腫瘤細胞在腹腔種植轉移。

腫瘤組織血管生成過程中，VEGF/VEGFR2 信號通路是最重要途徑之一［17］。VEGF 與其受體VEGFR2結合后，激活了受體酪氨酸激酶結構域的活性并上調了下游信號系統(tǒng)，通過增強內皮細胞有絲分裂和遷移能力、降解血管內皮外基質等生物活性，促進血管生成［18］。本研究的Western blot 結果顯示DS 組裸鼠腫瘤組織中CD163、VEGF、VEGFR2 的蛋白表達顯著低于對照組，表明DS可以抑制裸鼠胃癌肝轉移組織中M2型巨噬細胞和血管生成相關蛋白的表達，從而抑制血管生成進而抑制腹腔種植轉移。

綜上所述，DS 可以通過減少M2 型巨噬細胞的浸潤數(shù)量以及腫瘤組織中VEGF、VEGFR2 蛋白表達，從而抑制腫瘤血管生成，進而一定程度上抑制胃癌細胞腹腔種植轉移。M2 型巨噬細胞影響胃癌血管生成是一個復雜的、多因素參與的過程，關于DS 如何減少M2 型巨噬細胞的浸潤進而發(fā)揮抗胃癌血管生成和腹腔轉移的機制還需進一步研究。