胃饑餓素在缺血再灌注損傷介導(dǎo)肝纖維化中對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子的調(diào)控

屈豫花 劉仁貴 秦燕

1大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室（云南大理671000）；2大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外二科（云南大理671000）

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝移植、肝大部切除等肝臟外科手術(shù)的必然并發(fā)癥，嚴(yán)重影響術(shù)后患者的肝功能恢復(fù)和預(yù)后［1-3］。當(dāng)缺血時(shí)間到達(dá)閾值會(huì)導(dǎo)致肝纖維化，目前尚無(wú)有效的藥物和治療方案［4］。流行病學(xué)資料表明，肝纖維化評(píng)分越高，病死率也越高［5］。目前肝纖維化的機(jī)制尚不完全明確，也尚未發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的特效藥物和治療方式［6］。因此進(jìn)一步探討肝纖維化早期啟動(dòng)及發(fā)生發(fā)展機(jī)制，有利于對(duì)肝纖維化進(jìn)行有效的干預(yù)，提高慢性肝病患者的生存質(zhì)量。

國(guó)內(nèi)外最新研究提示基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）相互作用可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的降解［7］。MMPs 是一類(lèi)可以降解膠原的酶系，并對(duì)ECM 的重塑起著關(guān)鍵的作用［8］。MMPs 在嚙齒類(lèi)動(dòng)物肝臟組織中主要發(fā)揮作用的分型是MMP-13，可以切割天然纖維Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原，在早期纖維化階段，MMP-13 可以將原纖維膠原蛋白裂解為片段，逆轉(zhuǎn)肝纖維化［9］。TIMPs 特異抑制MMP-13 的活性，在纖維化的進(jìn)展期，大多數(shù)情況下TIMP-2 顯著升高［8］。研究表明在HIRI誘導(dǎo)肝纖維化的形成中，MMP-13 與TIMP-2 不僅參與了早期肝纖維化的啟動(dòng)，還促進(jìn)其后期的進(jìn)一步發(fā)展［10］。

胃饑餓素（Ghrelin）是體內(nèi)產(chǎn)生的一種肽類(lèi)激素，具有多種生理作用［11-13］。近年來(lái)研究表明其對(duì)器官缺血再灌注損傷及肝纖維化具有較好的保護(hù)作用［14-16］。但Ghrelin 逆轉(zhuǎn)或減輕HIRI 介導(dǎo)肝纖維化的作用機(jī)制尚未明確。本研究建立HIRI 介導(dǎo)肝纖維化的小鼠模型，探討Ghrelin 在HIRI 介導(dǎo)肝纖維化中對(duì)MMP-13 與TIMP-2 的動(dòng)態(tài)調(diào)控作用，為HIRI 介導(dǎo)肝纖維化的治療拓展新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57 小鼠，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量20 ～25 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK（滇）K2015-0002）。

1.1.2 藥物與試劑Ghrelin 多肽（Phoenix Pharmaceuticals Inc.）；Masson 三色染色試劑盒、Hyp 檢測(cè)試劑盒、ALT 試劑盒（南京建成）；引物合成（金斯瑞）；總RNA 提取試劑盒、TIANScript cDNA 試劑盒以及SuperReal PreMix Plus（天根）。

1.2.3 主要儀器PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；酶標(biāo)儀（奧地利安圖斯公司）；T6 紫外分光光度計(jì)（北京普析）；正置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）；ROBOZ血管夾（湖南遠(yuǎn)湘）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備、取材108 只C57 小鼠隨機(jī)平均分為假手術(shù)組（Sham 組）、肝缺血再灌注組（H/R 組）及Ghrelin 干預(yù)組（G-H/R 組），每組分0、3、6、72 h 及7、15 d 共6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)。Sham 組沿腹白線于劍突下開(kāi)口1 cm 左右，騷擾肝蒂部，90 min 后關(guān)腹。H/R 組手術(shù)開(kāi)口同Sham 組，用血管夾夾閉肝門(mén)靜脈、入肝左葉和中葉的肝動(dòng)脈90 min，打開(kāi)血管夾后關(guān)腹。Ghrelin 組分別在血管夾夾閉之前15 min 和打開(kāi)血管夾之前20 min 給與小鼠尾靜脈注射Ghrelin 溶液（25 μg/kg），余手術(shù)方式與H/R 組相同，每24 h 給術(shù)后小鼠尾靜脈注射Ghrelin 溶液（50 μg/kg）。取材時(shí)，達(dá)到各組模型相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給與心臟采血處死的方式，肝左葉置于4%多聚甲醛，肝中葉及肝左外側(cè)葉立即置于液氮凍存。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)采用比色法檢測(cè)血漿中ALT 水平，按說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出OD值，計(jì)算出ALT 酶活性。制備10%的肝組織勻漿，按說(shuō)明書(shū)操作，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，依公式計(jì)算出Hyp 含量。

1.2.3 肝組織蘇木精-伊紅（HE）染色4%多聚甲醛固定肝左葉，梯度組織脫水，透明，浸蠟后包埋為蠟塊。切片后置于60 ℃烘箱40 min 左右，切片梯度脫蠟。蘇木精5 min，鹽酸酒精30 s，氨水5 s，伊紅5 min，梯度脫水，透明，封片。

1.2.4 肝組織Masson 染色染色前同HE 染色前處理，脫蠟后蘇木素8 min，酸性乙醇10 s，水洗。Masson 藍(lán)化液5 min，水洗。麗春紅品紅8 min，弱酸工作液1 min，磷鉬酸2 min，弱酸工作液1 min。苯胺藍(lán)2 min，弱酸工作液1 min。梯度脫水，透明，封片。

光學(xué)顯微鏡觀察，按照第十次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議中《病毒性肝炎防治方案》中的規(guī)定對(duì)每個(gè)樣本的HE 染色結(jié)果和Masson 染色結(jié)果進(jìn)行肝纖維化程度分期。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)肝組織中α-SMA、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-13 和TIMP-2mRNA 表達(dá)水平嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，檢測(cè)濃度及完整性后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量檢測(cè)擴(kuò)增值。94 ℃變性5 min，退火溫度分別為：54 ℃、57 ℃、60 ℃、57 ℃和60 ℃、內(nèi)參60 ℃，時(shí)間1 min，延伸溫度72 ℃，3 min。40個(gè)循環(huán)。各個(gè)引物序列由Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血漿ALT 含量的變化與Sham 組相比，H/R 組血漿ALT 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；G-H/R 組與H/R 組相比，血漿ALT 水平均降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 各組小鼠肝組織Hyp 含量的變化H/R 組肝組織中Hyp 的含量隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，與Sham 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與H/R 組相比，G-H/R 各組Hyp 含量下降，72 h 之后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 小鼠血漿ALT 水平、肝組織Hyp 的含量Tab.2 Plasma ALT level of mice，expression level of Hyp in mouse liver ±s

表2 小鼠血漿ALT 水平、肝組織Hyp 的含量Tab.2 Plasma ALT level of mice，expression level of Hyp in mouse liver ±s

注：H/R 組與Sham 組相比較，*P ＜0.05；G-H/R 組與H/R 組相比較，**P ＜0.05

時(shí)間ALT（U/L）Sham 組H/R 組G-H/R 組Hyp（μg/g）Sham 組H/R 組G-H/R 組0 h 3 h 6 h 72 h 7 d 15 d 14.85±3.45 16.03±2.82 16.81±1.80 19.87±2.15 18.54±1.35 17.84±1.07 102.95±15.83*174.76±12.88*171.43±13.64*22.52±2.22 26.25±2.54*26.33±2.25*56.29±12.95**65.12±10.68**75.87±11.57**17.81±1.77**19.15±2.08**16.83±2.24**132.77±8.13 133.42±9.03 129.71±5.85 136.52±12.83 136.00±12.01 129.84±10.95 159.18±23.39*153.59±24.45 157.53±16.94*222.95±15.57*260.91±8.92*244.82±21.45*141.93±16.96 146.35±14.35 135.89±13.69 133.03±13.71**139.94±9.32**145.64±7.18**

2.3 各組小鼠肝組織中α-SMA mRNA 表達(dá)水平RT-PCR 結(jié)果顯示：H/R 組α-SMA mRNA 表達(dá)水平與Sham 組相比明顯增加（P＜0.05）。而G-H/R 組與H/R 組相比，α-SMA mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組小鼠肝組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)水平H/R 組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)水平與Sham 組相比明顯增加（P＜0.05）。與H/R 組相比，G-H/R 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化H/R 組小鼠肝臟在0、3、6 h 出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞氣球樣變性、脂肪變性、細(xì)胞核碎裂，72 h 出現(xiàn)細(xì)胞壞死、核溶解的現(xiàn)象，7、15 d 出現(xiàn)不同程度肝小葉間隔增寬、中央靜脈退化、肝竇毛細(xì)血管化等現(xiàn)象（圖1）。Masson染色結(jié)果顯示H/R 組肝組織與Sham 組相比7、15 d膠原纖維明顯擴(kuò)大（圖2）。而G-H/R 組與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)H/R 組比較，HE、Masson 染色的病理觀察結(jié)果均有所改善，趨向于Sham 組形態(tài)（圖1、2）。根據(jù)病理學(xué)觀察（圖1、2），對(duì)各組小鼠的纖維化程度進(jìn)行分期，見(jiàn)表5。

表3 α-SMA mRNA 表達(dá)水平Tab.3 mRNA expression level of α-SMA±s

表3 α-SMA mRNA 表達(dá)水平Tab.3 mRNA expression level of α-SMA±s

注：H/R 組與Sham 組相比較，*P ＜0.05；G-H/R 組與H/R 組相比較，**P ＜0.05

α-SMA 0 h 3 h 6 h 72 h 7 d 15 d Sham 組0.98±0.08 1.01±0.16 0.99±0.14 1.03±0.23 1.00±0.18 1.02±0.15 H/R 組1.96±0.18*2.16±0.24*2.19±0.42*6.98±0.66*10.43±0.91*15.08±1.21*G-H/R 組0.81±0.07**0.83±0.09**0.67±0.06**0.63±0.07**0.65±0.09**0.70±0.08**

2.6 各組小鼠肝組織中MMP-13、TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平與Sham 組相比，H/R 組MMP-13 的mRNA 表達(dá)水平在H/R 0、3 h 增加，隨后其表達(dá)水平逐漸下降，于7、15 d 降低至一個(gè)較低的水平（P＜0.05），TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05），MMP-13/TIMP-2 mRNA 比值在H/R 0、3 h 顯著升高（P＜0.05），隨后逐漸下降，于7 d 及15 d 顯著降低（P＜0.05）。與H/R 組相比，G-H/R 0、3、6、72 h 組MMP-13 mRNA 表達(dá)水平降低，7、15 d 組則升高（P＜0.05），TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），MMP-13/TIMP-2 mRNA 比值在G-H/R 0、3、6、72 h 組降低，而G-H/R 7、15 d 組則升高（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表4 Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)水平Tab.4 mRNA expression level of Col-I，Col-Ⅲ ±s

表4 Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)水平Tab.4 mRNA expression level of Col-I，Col-Ⅲ ±s

注：H/R 組與Sham 組相比較，*P ＜0.05；G-H/R 組與H/R 組相比較，**P ＜0.05

時(shí)間Collagen ⅠSham 組H/R 組G-H/R 組Collagen ⅢSham 組H/R 組G-H/R 組0 h 3 h 6 h 72 h 7 d 15 d 1.02±0.12 1.03±0.08 0.97±0.18 0.95±0.16 0.90±0.18 0.98±0.16 1.30±0.19*1.30±0.27*2.11±0.39*2.32±0.28*4.00±0.31*5.48±0.68*0.90±0.11**0.96±0.18**1.00±0.18**0.10±0.17**0.97±0.18**1.12±0.19**1.01±0.17 0.97±0.26 1.00±0.22 0.98±0.19 1.11±0.17 1.02±0.24 1.63±0.32*2.14±0.25*2.53±0.56*3.71±0.80*5.00±0.51*5.28±0.28*0.88±0.25**1.30±0.31**1.12±0.42**1.17±0.15**1.12±0.22**1.02±0.17**

3 討論

肝纖維化是各種慢性刺激（包括病毒感染、中毒、代謝、自身免疫性等）作用于肝臟引起的一種可逆性肝損傷［17-18］。肝纖維化中異常沉積的ECM主要來(lái)源于活化的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）。HSC 活化后，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹置讦?SMA能力的成纖維細(xì)胞，可以分泌大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，以及MMPs 與TIMPs。導(dǎo)致ECM 中的微環(huán)境發(fā)生紊亂，在這個(gè)過(guò)程中MMPs/TIMPs 的比值下降會(huì)導(dǎo)致ECM 沉積的量大于降解的量，形成肝纖維化［19］。目前尚無(wú)有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療方案，因此研究靶向MMPs/TIMPs 的調(diào)控可以為逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供理論基礎(chǔ)。Ghrelin 作為一種新的內(nèi)源性腦腸肽，研究表明Ghrelin 在肝損傷中可以減緩肝纖維化進(jìn)程［20］。然而Ghrelin 在HIRI 誘導(dǎo)肝纖維化中的研究較少，本實(shí)驗(yàn)探討Ghrelin 在HIRI誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)MMPs/TIMPs 的調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在HIRI 介導(dǎo)肝纖維化的過(guò)程中，損傷后0、3、6 h 肝細(xì)胞變性、壞死，HSC 活化，分泌大量的膠原成分，同時(shí)，由于肝臟對(duì)損傷產(chǎn)生的自然修復(fù)反應(yīng)，使肝臟分泌MMP-13 的能力增強(qiáng)，打破了MMP-13/TIMP-2 的平衡。在缺血再灌注后的15 d，肝細(xì)胞顯著減少，HSC 持續(xù)活化，構(gòu)成ECM 的膠原成分持續(xù)增多，同時(shí)MMP-13/TIMP-2 的比值下降，ECM 中的膠原在肝實(shí)質(zhì)中沉積，形成了肝纖維化。而Ghrelin 干預(yù)后，發(fā)揮穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的作用，對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，抑制受損肝臟中活化的HSC，減少膠原生成，同時(shí)影響肝組織MMP-13 的分泌，MMP-13/TIMP-2 的比值在后期上升，使ECM 降解大于合成，逆轉(zhuǎn)了HIRI 介導(dǎo)的肝纖維化。然而Ghrelin 發(fā)揮抑制HSC 的機(jī)制以及Ghrelin 調(diào)控MMP-13/TIMP-2 逆轉(zhuǎn)肝纖維化的最佳時(shí)間點(diǎn)在本研究中尚不具體，需要進(jìn)一步探究完善。

綜上所述，Ghrelin 在HIRI 介導(dǎo)的肝纖維化早期及進(jìn)展期對(duì)MMP-13/TIMP-2 均有調(diào)控作用，使MMP-13 的分泌發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，持續(xù)下調(diào)TIMP-2 的分泌，在新的水平調(diào)控MMP-13/TIMP-2 二者的關(guān)系，進(jìn)而使ECM 的合成小于降解，抑制肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)一步發(fā)展，為臨床上減緩肝纖維化發(fā)展進(jìn)程提供新的治療思路。

圖1 小鼠肝組織HE 染色（×400）Fig.1 HE staining of mouse liver（×400）

圖2 小鼠肝組織Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining of mouse liver（×200）

表5 各組肝纖維化程度分級(jí)Tab.5 Grade of liver fibrosis in each group

表6 MMP-13、TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平Tab.6 mRNA expression level of MMP-13，TIMP-2±s

表6 MMP-13、TIMP-2 mRNA 表達(dá)水平Tab.6 mRNA expression level of MMP-13，TIMP-2±s

注：H/R 組與Sham 組相比較，*P ＜0.05；G-H/R 組與H/R 組相比較，**P ＜0.05

因子MMP-13 TIMP-2 MMP-13/TIMP-2分組Sham 組H/R 組G-H/R 組Sham 組H/R 組G-H/R 組Sham 組H/R 組G-H/R 組0 h 1.01±0.13 2.94±0.47*1.02±0.14**1.01±0.24 1.62±0.36*1.02±0.29**1.07±0.36 1.87±0.40*1.07±0.37**3 h 1.01±0.13 5.53±1.26*0.90±0.19**1.00±0.18 1.60±0.28*0.91±0.22**1.05±0.26 3.59±1.17*1.06±0.38**6 h 1.04±0.27 1.49±0.25*0.70±0.10**1.01±0.15 1.51±0.23*1.02±0.20**1.04±0.24 1.00±0.21 0.71±0.17**72 h 1.01±0.19 1.51±0.55 0.81±0.13**0.95±0.15 1.51±0.22*1.05±0.18**1.07±0.20 0.99±0.32 0.80±0.20 7 d 1.05±0.22 0.50±0.12*0.74±0.10**1.02±0.20 1.92±0.52*1.00±0.25**1.02±0.13 0.28±0.10*0.79±0.23**15 d 1.01±0.17 0.38±0.12*0.80±0.09**1.04±0.19 2.33±0.43*0.94±0.24**0.98±0.12 0.17±0.06*0.90±0.21**