疏肝和胃方對肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響

王 敏，曾代文，，溫珠明

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是一類常見的消化道疾病，具有病程長，復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，不僅影響患者生活質(zhì)量也加大患者的醫(yī)療支出。中醫(yī)理論中，肝郁脾虛是此類疾病主要病機(jī)之一。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICCs)是胃腸道運(yùn)動(dòng)的起搏、調(diào)節(jié)細(xì)胞[1]。干細(xì)胞生長因子受體(c-kit)為ICCs特異性表達(dá)蛋白，c-kit表達(dá)受損會(huì)導(dǎo)致平滑肌收縮障礙，影響胃腸道運(yùn)動(dòng)[2]。本疏肝和胃方為曾代文醫(yī)師由中醫(yī)經(jīng)典方《六君子湯》、《左金丸方》加減得來，主以健脾祛濕，佐以疏肝和胃之法，在數(shù)十年臨床治療肝郁脾虛性功能性消化不良中取得了較好療效。莫沙必利為臨床治療功能性消化不良的常用藥，主要通過促進(jìn)胃腸動(dòng)力改善相關(guān)癥狀。本研究以多因素復(fù)合夾尾法模擬中醫(yī)病機(jī)制造肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠模型[3]，對比莫沙必利，研究疏肝和胃方對于肝郁脾虛證FD大鼠胃腸動(dòng)力、ICCs凋亡、c-kit表達(dá)的影響，揭示疏肝和胃方可能的作用機(jī)制，為后續(xù)藥物開發(fā)及臨床使用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體重(216.9±13.7)g，均采購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠恒溫飼養(yǎng)，溫度(22±2) ℃，空氣濕度40%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分四組，即對照組、模型組、莫沙組、疏肝組各10只。

1.2 主要藥物①疏肝和胃藥液：南沙參、白術(shù)(生)、茯苓、陳皮、半夏、黃連、吳茱萸(清炒)、甘草，均由四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部庫房采購(四川中藥飲片有限責(zé)任公司)。稱取上述藥材，第一次加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮1 h，濾過，收集濾液；再分別加以8倍量、6倍量水進(jìn)行第二次、第三次煎煮，時(shí)間均為0.5 h，濾過，收集濾液。合并三次濾液，濃縮、醇沉、回收乙醇、定容，制成濃度為0.95 g/ml的藥液。②莫沙必利混懸液：精密稱取適量枸櫞酸莫沙比利分散片(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字： H20031116，批號：180418)，以蒸餾水制成濃度為0.15 mg/ml的混懸液。③半固體營養(yǎng)糊：奶粉8 g、CMC-Na 5 g、淀粉4 g、糖4 g、活性炭3 g依次攪拌加入150 ml蒸餾水中，混合均勻，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器Tunel試劑盒(Roche，11684817910)，C-kit 抗體(Thermo，PA5-16770)，CY3山羊抗兔抗體(GB21303)，DAPI(Servicebio，G1012)，抗熒光淬滅封片劑(Servicebio，G1401)，PBS緩沖液(Servicebio)，破膜液(Servicebio)，蛋白酶K(Servicebio)，BSA(Servicebio)；移液槍，組化筆，正置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE C1)、成像系統(tǒng)(NIKON DS-U3)。

1.4 方法2019年4～6月，對照組常規(guī)喂養(yǎng)，其余3組采用疲勞+飲食不規(guī)律+夾尾刺激法進(jìn)行造模，為期14 d。造模14 d，大鼠體重下降、毛色枯黃、大便稀溏、易受刺激即提示造模成功。實(shí)驗(yàn)3～4 w為給藥期。對照組、模型組、莫沙組、疏肝組每日分別以蒸餾水、蒸餾水、莫沙必利混懸液、疏肝和胃藥液灌胃給藥進(jìn)行治療，灌胃體積1 ml/100 g，每日稱重。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1基本情況 觀察并記錄各組大鼠日常行為學(xué)情況、排便情況以及體重變化。

1.5.2胃腸動(dòng)力 測定給藥期結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)大鼠均禁食但不禁水1 d。實(shí)驗(yàn)第29 d，每只大鼠灌胃2 ml半固體營養(yǎng)糊，30 min后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。麻醉后迅速解剖，分離胃、小腸，進(jìn)行稱重、測量，計(jì)算胃排空率、小腸推進(jìn)率：胃排空率=[(胃全重-胃凈重)/灌胃量]×100%。小腸推進(jìn)率=碳墨在小腸推進(jìn)的距離/小腸總長度×100%。

1.5.3C-KIT、TUNEL免疫熒光雙染 胃稱重完成后，剪取大小約為0.5 cm3胃竇組織，生理鹽水清洗，石蠟切片脫蠟至水，組化筆圈選組織后滴加蛋白酶K，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌15 min；切片加入破膜液，常溫孵育20 min，PBS洗滌；加入適量TdT、dUTP混合液(1∶9)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌，3%BSA室溫孵育30 min；加入c-kit抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，CY3山羊抗兔抗體(1∶300)室溫避光孵育50 min；PBS洗滌，DAPI室溫避光孵育10 min，PBS洗滌，抗熒光猝滅封片劑進(jìn)行封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行全片掃描采集圖像。

采用Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA)對切片ICCs凋亡率、 c-kit 平均光密度值(aevarage optical density，AO)進(jìn)行分析：凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%；AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達(dá)水平越高。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。組間數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)采用方差分析，非正態(tài)分布則采用Kruskal-wallisH檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況所有大鼠初始狀態(tài)良好，毛色光潔，行動(dòng)自如。造模期間，對照組大鼠飼料消耗逐增、排便正常、毛色光潔、活動(dòng)自如，體重逐漸增加；造模初始，造模大鼠掙扎尖叫，暴躁，出現(xiàn)打架情況，后期反抗減弱，毛色逐漸枯黃，便溏次數(shù)增多，體重逐漸下降；造模結(jié)束，造模大鼠多倦怠，蜷于籠內(nèi)一角，毛色枯黃，多便溏，體重減輕。治療期間，莫沙組、疏肝組大鼠毛色逐漸恢復(fù)，飼料消耗逐漸增加；治療結(jié)束后，莫沙組、疏肝組大鼠活動(dòng)自如活躍，便溏減輕，毛色多柔順光潔。體重造模2 w后，相較于對照組，模型組、莫沙組、疏肝組體重均有顯著下降(P均<0.01)，提示造模成功。實(shí)驗(yàn)4 w后，模型組體重仍顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，莫沙組、疏肝組與對照組相比，體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化 (g)

2.2 各組胃腸動(dòng)力的比較與對照組相比，模型組胃排空率較低(P<0.01)；莫沙組、疏肝組與對照組胃排空率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；莫沙組、疏肝組胃排空率均顯著高于模型組(P<0.01)。模型組小腸推進(jìn)率明顯低于對照組、莫沙組、疏肝組(均P<0.01)；莫沙組、疏肝組小腸推進(jìn)率與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率比較 (%)

2.3 胃竇組織ICCs凋亡、c-kit表達(dá)情況胃竇組織中，ICCs(紅色標(biāo)記)多分布于環(huán)形肌層、肌間叢、黏膜下層等部位，細(xì)胞多處突起，互相連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列緊密(圖1a)。凋亡細(xì)胞多成聚集或散在分布于肌層邊緣及黏膜下層等部位(圖4b)。模型組c-kit陽性表達(dá)相較于對照組出現(xiàn)明顯下降。疏肝組、對照組c-kit表達(dá)較模型組有明顯增強(qiáng)，但疏肝組、莫沙組c-kit表達(dá)仍低于對照組，對照組、莫沙組、疏肝組ICCs凋亡率均顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。莫沙組、疏肝組ICCs凋亡率與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠胃竇組織ICCs凋亡率及c-kit AO值 (%)

圖1 各組大鼠胃竇組織TUNEL、c-kit雙重免疫組化圖(×400) a:ICCs分布及c-kit表達(dá)圖；b:ICCs凋亡圖。紅色為c-kit陽性表達(dá)的ICC細(xì)胞，綠色為凋亡細(xì)胞，黃色為凋亡的c-kit陽性ICC細(xì)胞

3 討論

在中醫(yī)理論中，功能性消化不良屬于“胃脘病”的范疇，它多發(fā)于胃，同時(shí)還與肝脾關(guān)系密切?！毒霸廊珪て⑽浮氛f到，“胃司受納，脾主運(yùn)化，一運(yùn)一納，化生精氣”，脾胃良好的氣機(jī)升降對于食物納受消化具有重要作用，若脾胃氣機(jī)升降失調(diào)則對食物消化能力產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致“痞滿”等癥狀的發(fā)生。肝主疏瀉，肝氣條達(dá)，則全身氣機(jī)暢通，能夠協(xié)助脾胃升降，從而促進(jìn)脾胃的運(yùn)化。肝郁氣機(jī)升降不暢，脾虛水谷運(yùn)化失調(diào)，則出現(xiàn)“噯氣”、“痞滿”、“胃脘痛”等病征[4]。運(yùn)用疏肝和胃法，對功能性消化不良取得了較好的療效[5，6]。

目前對于FD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，眾多臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明其與胃腸功能障礙、內(nèi)臟高敏感、胃酸分泌異常、幽門螺旋菌感染、腦腸肽及精神心理因素等存在相關(guān)性[7，8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，造模后的大鼠，胃排空明顯延遲、小腸推進(jìn)率減弱明顯，出現(xiàn)嚴(yán)重胃腸動(dòng)力障礙。上述癥狀在約70%的FD患者中以不同程度存在[9]。產(chǎn)生胃腸動(dòng)力障礙普遍認(rèn)為有兩方面原因，一方面為神經(jīng)遞質(zhì)和胃腸激素所誘導(dǎo)的平滑肌收縮舒張異常，另一方面則是胃腸道肌電活動(dòng)異常。作為胃腸道運(yùn)動(dòng)的起搏以及調(diào)節(jié)細(xì)胞，ICCs能與胃腸道神經(jīng)、平滑肌細(xì)胞形成神經(jīng)纖維ICCs平滑肌細(xì)胞 (ENS-ICCs-SMC) 網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生胃腸道運(yùn)動(dòng)起步的慢波電位，同時(shí)介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生和調(diào)節(jié)，形成腸道動(dòng)力功能的基本單位[10，11]。ICCs能特異性表達(dá)c-kit，失去c-kit表達(dá)的間質(zhì)細(xì)胞不能誘導(dǎo)產(chǎn)生平滑肌收縮運(yùn)動(dòng)[12]，此外，作為酪氨酸激酶受體(kit)家族一員，c-kit能夠編碼kit，進(jìn)而參與ICCs增殖分化，調(diào)控ICCs表型表達(dá)及變化[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，在胃食管反流病發(fā)生時(shí)，相關(guān)區(qū)域的ICCs陽性面積及染色強(qiáng)度均出現(xiàn)下降[14]，且下降強(qiáng)度與胃食管反流病嚴(yán)重程度相關(guān)[15]；糖尿病胃輕癱的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致胃內(nèi)ICCs超微結(jié)構(gòu)受損，形態(tài)結(jié)構(gòu)的受損、數(shù)量的減少，從而進(jìn)一步加重胃腸動(dòng)力障礙。研究人員發(fā)現(xiàn)，刺激骶尾神經(jīng)后的大鼠c-kit表達(dá)提高，腸道運(yùn)輸加快進(jìn)而提高了結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能[16]；進(jìn)行結(jié)腸吻合術(shù)后的大鼠，c-kit表達(dá)下降、小腸蠕動(dòng)減慢，通過針灸，c-kit表達(dá)增加，促進(jìn)了ICCs和腸道運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[17]。

在FD的中醫(yī)藥基礎(chǔ)以及臨床現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯對于腸道功能具有雙相調(diào)節(jié)作用，能夠增加FD大鼠ICCs數(shù)量[18]，修復(fù)受損ICCs超微結(jié)構(gòu)[19]；健脾疏肝和胃方可通過上調(diào)ICCs表達(dá)，提高胃排空率對FD進(jìn)行治療[20]，疏肝理氣法可能通過下調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caapase9，上調(diào)Bcl-2、PI3K、PDK1、Akt等蛋白表達(dá)對PI3K/PDK1/Akt信號通路進(jìn)行調(diào)控，從而減少由陽明腑實(shí)證引起的胃ICCs凋亡[21]；養(yǎng)陰潤腸湯能夠通過恢復(fù)SCF/c-kit通路，進(jìn)而提高慢傳輸性便秘大鼠的ICC數(shù)量和表達(dá)，改善相應(yīng)癥狀[22]；運(yùn)用電針治療，能顯著增加肝郁脾虛FD大鼠胃電波節(jié)律和胃竇組織ICC表達(dá)[23]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ICCs凋亡明顯、c-kit表達(dá)減弱，出現(xiàn)明顯的胃腸動(dòng)力障礙，疏肝和胃方能顯著緩解模型大鼠ICCs凋亡、在一定程度上恢復(fù)c-kit表達(dá)，改善模型大鼠胃腸動(dòng)力。對于模型大鼠出現(xiàn)的情志不條、行為倦怠等基本情況也有一定改善?？赡艿靡嬗诒痉姜?dú)特的疏肝和胃之法，“肝主情志”、“胃不和則臥不安”，肝氣條達(dá)脾胃調(diào)和則情志舒緩。

綜上所述，本疏肝和胃方對于肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠出現(xiàn)的胃腸動(dòng)力障礙有一定治療作用，可能的機(jī)制為在一定程度上上調(diào)c-kit表達(dá)、促進(jìn)凋亡ICCs的恢復(fù)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后的大鼠ICCs凋亡嚴(yán)重，c-kit表達(dá)發(fā)生明顯下降，進(jìn)而出現(xiàn)相應(yīng)的胃腸動(dòng)力障礙。