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    甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)代謝及肝毒性研究

    2020-09-23 04:51:30蘇美珍張祎桐呂利群
    水產(chǎn)科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:異育銀谷草歧化酶

    蘇美珍,張祎桐,王 浩,呂利群

    ( 1.上海海洋大學(xué),國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù),上海 201306; 2.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306; 3.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306 )

    甲苯咪唑(MBZ)屬于苯并咪唑類(lèi)藥物,又名甲苯達(dá)唑、二苯酮咪胺酯、安樂(lè)土,其化學(xué)名為(5-苯甲酰基-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯,是一種廣譜性驅(qū)蟲(chóng)藥物,可用于防治蛔蟲(chóng)、絲蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)(Enterobiusvermicularis)、鞭蟲(chóng)(Trichuristrichura)、糞類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)(Strongyloidesstercoralis)等腸道寄生蟲(chóng)的疾病[1-3]。

    近年來(lái),隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展,也帶來(lái)了魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)感染病,造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,逐漸引起人們的重視[4]。甲苯咪唑作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)的治療寄生蟲(chóng)疾病的藥物,其副作用和殘留量較大??诠嗟募妆竭溥蛑饕じ皆谀c道部位,吸收后分布在血液、腎臟、肝臟等部位,主要分布在肝胰臟[5]??诜妆竭溥蛞矔?huì)損傷魚(yú)類(lèi)的生理功能。20多年的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),口服甲苯咪唑會(huì)帶來(lái)一系列的不良反應(yīng)[6-8]。需氧生物在氧化還原中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧,而活性氧是自由基的重要組成部分,少量的自由基是必需,但是,自由基過(guò)量就會(huì)對(duì)生物機(jī)體造成氧化損傷。生物在生長(zhǎng)過(guò)程中,體內(nèi)形成了一套完整清理機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基的抗氧化系統(tǒng)[9]。其中超氧化物歧化酶是抗氧化酶系統(tǒng)重要成分之一,是一種能反映機(jī)體清除自由基能力的酶[10]。過(guò)氧化氫酶也是一種抗氧化劑酶,對(duì)于防止產(chǎn)生有害的陰離子,在減輕氧化損傷中起到重要的作用。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是一種氧自由基捕獲劑。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶屬于抗氧化劑酶,都是描述藥物綜合毒理學(xué)效應(yīng)的酶類(lèi)。機(jī)體損傷時(shí)會(huì)破壞抗氧化酶的活性,改變抗氧化酶基因的表達(dá)[11]。堿性磷酸酶在生物體解毒過(guò)程中起重要的作用;谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸間氨基轉(zhuǎn)移的一類(lèi)酶。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于心肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中,血清中含量很少。但機(jī)體發(fā)生損傷時(shí),細(xì)胞內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶會(huì)從細(xì)胞中逸出到血液,血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性就會(huì)增加[12]。堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶與肝功能有關(guān),易受環(huán)境的影響,即肝細(xì)胞受損時(shí),就會(huì)觸發(fā)這些酶的活性。

    得益于魚(yú)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究方法的成熟,制定甲苯咪唑在異育銀鯽各組織中的代謝曲線(xiàn)為其休藥期的制定提供了依據(jù)。但是迄今未見(jiàn)甲苯咪唑在異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)體內(nèi)藥物毒性的研究。我國(guó)異育銀鯽的年產(chǎn)量接近2.5×106t,但疾病頻發(fā),養(yǎng)殖用藥量大且用藥安全風(fēng)險(xiǎn)高,出于合理用藥、安全用藥的需要,筆者比較了甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟的富集水平,研究其最高富集組織中藥物的肝毒性,為甲苯咪唑的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    體表健康的異育銀鯽300尾,體質(zhì)量(90±20) g,購(gòu)于中國(guó)江蘇省烏江縣,暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)水族箱,試驗(yàn)水溫(20±2) ℃,正常供氧,試驗(yàn)前24 h停止投喂。

    99%甲苯咪唑原粉,0.22 μm有機(jī)系濾頭,1 mL一次性滅菌注射器,草酸鉀,氯化鈉,DEPC水[生工生物工程(上海)股份有限公司];99.5%甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品(含量 99.5%)(Ehrenstorfer Quality);甲醇(色譜級(jí)),甲酸(色譜級(jí)),乙腈,水(色譜級(jí)),三氯甲烷(中國(guó)上海國(guó)藥化學(xué)試劑);CNW 9 mm棕色螺旋口自動(dòng)進(jìn)樣瓶,250 μL尖底玻璃內(nèi)插管,9 mm開(kāi)孔擰蓋(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);過(guò)氧化物歧化酶試劑盒,過(guò)氧化氫酶試劑盒,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒,堿性磷酸酶試劑盒,谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒,谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒,總蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所);TRlzol(Invitrogen公司);PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit,TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司)。

    UPLC/MS線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀(Waters公司);漩渦混勻器(上海本昂科學(xué)儀器有限公司);TDL8M臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀器有限公司);超純水儀(成都浩純儀器設(shè)備責(zé)任有限公司);超聲波清洗機(jī)(上海分析超聲儀有限公司);低溫保藏箱(Haier公司);組織勻漿儀(Sigma公司);電子分析天平(上海??祪x器有限公司);多功能酶標(biāo)儀(Promege公司);CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

    1.2 甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

    準(zhǔn)確稱(chēng)取甲苯咪唑10 mg,用88%甲酸溶解于100 mL棕色量瓶中,加入色譜級(jí)甲醇到刻度線(xiàn)后充分混勻,配置質(zhì)量濃度為100 μg/mL的甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將配置好的甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋為0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg/mL,然后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    1.3 色譜條件

    樣品分析儀為UPLC/MS線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀,色譜柱是Hypersil Gold,規(guī)格為100 mm×2.1 mm,1.9 μm,流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量5 μL,柱溫30 ℃,離子源ESI,正離子模式,錐孔電壓30 V,掃描方式多離子監(jiān)測(cè),脫溶劑氣溫150 ℃,脫溶劑氣流量600 L/h,離子對(duì)(定量離子對(duì)和定性離子對(duì))m/z為264~296。洗脫程序見(jiàn)表1。

    表1 梯度洗脫程序表

    1.4 方法

    由300尾健康異育銀鯽中隨機(jī)選取數(shù)尾。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg 甲苯咪唑,先用少許的甲酸溶解,再用蒸餾水定容,配制為4 mg/mL。按照20、10、5 mg/kg的藥量用胃管灌胃給藥。在給藥后1、2、4、6、10、24、48、84 h自魚(yú)尾靜脈取血。在取出的血中立即加入2%的草酸鉀抗凝劑(抗凝劑∶血漿=1∶10,體積比)混勻,然后以4000 r/min離心10 min;同時(shí)迅速取肝胰臟和腎臟樣品。所有樣品放置冰箱-80 ℃冷凍保存。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3尾魚(yú),3個(gè)平行。

    隨機(jī)選取數(shù)尾健康異育銀鯽,分為兩組。第一組對(duì)照組口灌5%甲酸,第二組試驗(yàn)組口灌20 mg/kg甲苯咪唑。分別在給藥后的0、24、48 h取肝臟處理測(cè)定超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性和超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶基因的表達(dá)量情況。

    甲苯咪唑藥代樣品處理方法參考文獻(xiàn)[13]。將血漿、肝臟、腎臟樣品在室溫下自然解凍,取500 μL血液于2 mL離心管中加入750 μL甲醇,6000 r/min離心5 min,取上清液。重復(fù)2次,合并上清液于1200 r/min離心20 min,取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜,濾液待上機(jī)檢測(cè)。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g的肝胰臟和0.2 g的腎臟于15 mL離心管中,分別加入1 mL的甲醇,用組織勻漿機(jī)勻漿,6000 r/min離心10 min,取上清液。重復(fù)2次,合并上清液,分別加入1 mL正己烷,混勻,于12 000 r/min離心10 min,濾液過(guò)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜,濾液待上機(jī)檢測(cè)。

    魚(yú)體超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶和堿性磷酸酶活力測(cè)定:分別取口灌20 mg/kg 甲苯咪唑后0、24、48 h的異育銀鯽肝胰臟于預(yù)冷的0.86%氯化鈉中漂洗,除去血液,濾紙擦干。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g肝胰臟樣品放入2 mL離心管中,加入0.86%氯化鈉,用組織勻漿機(jī)勻漿(加入生理鹽水的體積總量是樣品質(zhì)量的9倍)制作成10%的組織勻漿,之后于2000 r/min離心10 min。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性。

    血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定:分別取口灌0、24、48 h后魚(yú)的血漿,立即加入2%的草酸鉀抗凝劑(抗凝劑∶血漿=1∶10,體積比)混勻,于1000 r/min離心5 min,取上清液。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。

    肝胰臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)量的測(cè)定:分別取口灌0、24、48 h魚(yú)的肝胰臟,用Trizol法從肝胰臟中分離總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)測(cè)定超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)量的變化。所用的引物由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上查找異育銀鯽的序列合成,引物序列見(jiàn)表2。采用TBgreen酶。Real time PCR程序:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,共37個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)分析:95 ℃ 10 s,65 ℃ 5 s,溫度由65 ℃升至95 ℃,此過(guò)程不斷收集熒光信號(hào),形成熔解曲線(xiàn)。測(cè)定口灌0、24、48 h異育銀鯽超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶兩種基因表達(dá)量的變化。

    表2 試驗(yàn)中所用到的引物

    1.5 回收率及精密度

    回收率:取空白的血清500 μL加入1 mg/mL的甲苯咪唑溶液,取肝胰臟0.2 g,腎臟0.2 g分別加入少許甲醇進(jìn)行組織勻漿,然后再分別加入1 mg/mL的甲苯咪唑溶液。之后分別稀釋為1.0、0.5、0.1 μg/mL,按照甲苯咪唑樣品預(yù)處理的方法處理,測(cè)定回收率。每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行,取其平均值為實(shí)際測(cè)定質(zhì)量濃度。

    回收率/%=Cr/C0×100%

    式中,Cr為空白樣品(血液或者肝腎臟)加入了一定量的甲苯咪唑后測(cè)定的試劑質(zhì)量濃度,C0為加入一定量甲苯咪唑已知標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度。

    精密度:同一樣品1 d內(nèi)不同時(shí)間測(cè)3次,連續(xù)測(cè)3 d,之后測(cè)定血液、肝胰臟、腎臟中甲苯咪唑的日內(nèi)和日間平均變異系數(shù),來(lái)判斷該方法的精密度。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    圖表用Excel 2010制作,使用DAS 3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件、Masslynx V 4.1軟件和SPSS軟件分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    2 結(jié) 果

    2.1 甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

    甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)為y=57 387.6x+112 015(r2=0.989903),在1~50 ng/mL內(nèi),甲苯咪唑的峰面積與其質(zhì)量濃度呈較好的線(xiàn)性關(guān)系(圖1)。

    圖1 甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

    2.2 回收率與精密度

    由表3可知,在含有甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品1.0、0.5、0.1 μg/mL的組織樣品中,異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟樣品中的回收率分別為79.91%~83.68%、78.23%~89.46%和87.26%~95.94%;其日內(nèi)變異系數(shù)分別為1.16%~8.22%、0.51%~2.83%和1.81%~13.59%;日間變異系數(shù)為1.04%~2.29%、1.98%~7.32%和1.81%~2.96%。表明此方法處理樣品組織,可以得到較高的回收率,重復(fù)性良好。

    表3 異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中甲苯咪唑的回收率和變異系數(shù)

    2.3 甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律

    分別口灌20、10、5 mg/kg 甲苯咪唑后,異育銀鯽血液、肝胰臟、腎臟中的藥時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2~圖4。3種質(zhì)量濃度甲苯咪唑分別在血液、肝胰臟和腎臟中的藥時(shí)曲線(xiàn)變化基本一致,均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。

    由圖2可見(jiàn),口灌20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑24 h時(shí),異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑含量分別為6.1163、1.1026、0.2005 μg/g;24 h后異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑含量則開(kāi)始迅速下降??诠嗖煌瑒┝亢?,甲苯咪唑在異育銀鯽組織中含量分布為肝胰臟>腎臟>血液。

    圖2 不同劑量下異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑的藥—時(shí)曲線(xiàn)

    由圖3可見(jiàn),口灌質(zhì)量濃度為20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑24 h時(shí),異育銀鯽血液中甲苯咪唑含量達(dá)最大值,分別為0.1837、0.0540、0.0067 μg/mL,0~24 h異育銀鯽血液中甲苯咪唑含量呈上升趨勢(shì),達(dá)到最高峰后甲苯咪唑含量則開(kāi)始下降,在84 h時(shí)甲苯咪唑在異育銀鯽血液中幾乎被代謝完全。

    圖3 不同劑量下異育銀鯽血液中甲苯咪唑的藥—時(shí)曲線(xiàn)

    由圖4可見(jiàn),口灌20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑后,肝胰臟中甲苯咪唑含量呈先升后降的趨勢(shì),在24 h時(shí)甲苯咪唑含量達(dá)最高值,分別為8.2248、3.3963、0.5744 μg/g;24 h后肝胰臟中的甲苯咪唑則被逐漸代謝掉,到84 h時(shí),肝胰臟中的甲苯咪唑含量幾乎被代謝完全。

    圖4 不同劑量下異育銀鯽肝胰臟中甲苯咪唑的藥—時(shí)曲線(xiàn)

    用DAS 3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析藥代數(shù)據(jù)后所得的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4??诠?0、10、5 mg/kg甲苯咪唑后,異育銀鯽血液中甲苯咪唑峰質(zhì)量濃度分別為0.1837、0.0540、0.0067 μg/mL,達(dá)峰時(shí)間均為24 h,藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0~t)和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0~∞)分別為6.497 mg/(L·h)和11.815 mg/(L·h)、1.622 mg/(L·h)和1.648 mg/(L·h)、0.274 mg/(L·h)和0.355 mg/(L·h),消除半衰期分別為51.788、16.312、43.841 h。肝胰臟中甲苯咪唑峰含量分別為8.2248、3.3963 μg/g和0.5744 μg/g,達(dá)峰時(shí)間均為24 h,藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0~t)和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0~∞)分別為271.527 mg/(L·h)和284.857 mg/(L·h)、129.337 mg/(L·h)和131.734 mg/(L·h)、27.994 mg/(L·h)和32.123 mg/(L·h),消除半衰期分別為21.237、12.575、25.02 h。腎臟中甲苯咪唑峰含量分別為6.1163、1.1026、0.2005 μg/g,達(dá)峰時(shí)間均為24 h,藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0~t)和藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(0~∞)分別為161.803 mg/(L·h)和162.531 mg/(L·h)、45.705 mg/(L·h)和45.933 mg/(L·h)、7.396 mg/(L·h)和8.117 mg/(L·h),消除半衰期分別為9.192、9.326 h和34.914 h。

    表4 口灌不同劑量甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    2.4 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽肝胰臟相關(guān)酶活性影響

    2.4.1 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

    異育銀鯽口灌20 mg/kg甲苯咪唑后,肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶活性呈時(shí)間依賴(lài)性下降(圖5a)。肝胰臟中的堿性磷酸酶活性呈先升后降的趨勢(shì)(圖5b)。在24 h時(shí)堿性磷酸酶活性遠(yuǎn)高于0 h時(shí),此時(shí)對(duì)照組甲酸對(duì)肝胰臟中堿性磷酸酶活性的影響也較大;48 h時(shí)肝胰臟中堿性磷酸酶活性高于0 h,低于24 h。肝胰臟中過(guò)氧化氫酶的活性呈先升后降的變化趨勢(shì),給藥24 h時(shí),過(guò)氧化氫酶在肝臟中的活性值最高;48 h時(shí)較0 h時(shí)有所升高,較24 h下降(圖5c)。給藥后肝胰臟中超氧化物歧化酶活性先升后降,給藥24 h,肝胰臟中超氧化物歧化酶活性達(dá)最高值;48 h肝胰臟中超氧化物歧化酶活性較0 h時(shí)有所上升,較24 h時(shí)有所下降(圖5d)。

    圖5 口灌20 mg/kg甲苯咪唑異育銀鯽肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的變化

    2.4.2 口灌甲苯咪唑后異育銀鯽血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

    異育銀鯽口灌20 mg/kg甲苯咪唑后,血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性先升后降,給藥24 h時(shí),血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最高,給藥48 h時(shí),血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性較24 h下降,較0 h上升(圖6)。對(duì)照組口灌甲酸后,對(duì)血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性影響不大。

    圖6 口灌20 mg/kg 甲苯咪唑異育銀鯽肝胰臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化

    2.5 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽氧化應(yīng)激超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)的影響

    口灌20 mg/kg甲苯咪唑后,肝胰臟中超氧化物歧化酶基因的mRNA水平減少,24 h時(shí)超氧化物歧化酶基因的mRNA水平最低,甲苯咪唑處理組和甲酸對(duì)照組都使超氧化物歧化酶基因表達(dá)下調(diào)(圖7a)。給藥后,甲苯咪唑處理組和甲酸對(duì)照組都使肝胰臟中的過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)下調(diào);同樣,在24 h時(shí),過(guò)氧化氫酶基因的mRNA水平達(dá)最小值(圖7b)。

    圖7 口灌20 mg/kg甲苯咪唑后異育銀鯽肝胰臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

    3 討 論

    3.1 甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的吸收與分布特征

    濫用水產(chǎn)藥物可使魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生耐藥性或藥物殘留在魚(yú)體和人體內(nèi),很有可能危及人類(lèi)的健康。所以研究藥物在魚(yú)體內(nèi)的代謝及其對(duì)魚(yú)類(lèi)的損傷迫在眉睫。不同時(shí)間甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中的分布情況為:在0~24 h之間在體內(nèi)的含量逐步升高,24 h時(shí)達(dá)到最高峰,24 h后開(kāi)始下降。這說(shuō)明口灌24 h內(nèi),甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)被吸收,24 h后異育銀鯽體內(nèi)的甲苯咪唑不斷發(fā)生代謝??诠?0 mg/kg甲苯咪唑24 h時(shí),血液、肝胰臟和腎臟中的甲苯咪唑含量分別為0.1837、8.2248、6.1163 μg/g,84 h時(shí)分別為0.0013、0.4317、0.0623 μg/g??梢钥闯觯?4 h時(shí)甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)已基本代謝完。這一代謝規(guī)律與文獻(xiàn)[14-15]的論述類(lèi)似:甲苯咪唑在團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)體內(nèi)主要代謝物及其變化規(guī)律,在給藥24 h,體內(nèi)的甲苯咪唑含量也不斷增高,在24 h含量達(dá)到峰值;在復(fù)方甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),前期復(fù)方甲苯咪唑在體內(nèi)快速吸收達(dá)到峰值后,藥物開(kāi)始在體內(nèi)代謝;在96 h時(shí)復(fù)方甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)幾乎被代謝完全。

    本試驗(yàn)中,給藥24 h時(shí),魚(yú)體各組織中甲苯咪唑達(dá)到峰值的順序?yàn)椋焊我扰K>腎臟>血液,肝臟中的甲苯咪唑吸收最快,分布最多,而血液中甲苯咪唑的含量低于肝胰臟和腎臟。這可能是因?yàn)楦我扰K是主要的解毒器官,相比其他組織吸收更快;其次可能是因?yàn)榧妆竭溥蛉芙舛鹊?,在腸壁和肝臟中存在著首過(guò)效應(yīng)[13],所以大部分藥物主要存在于肝胰臟或者腎臟中,所以推測(cè)甲苯咪唑的吸收和分布情況可能與藥物的理化性質(zhì)和魚(yú)體組織器官有關(guān)[16]。此次對(duì)甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的藥代研究也給有關(guān)部門(mén)制定甲苯咪唑最高殘留量以及休藥期提供了參考。

    3.2 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽的肝毒性分析

    正常情況下,動(dòng)物體內(nèi)的氧化—抗氧化系統(tǒng)呈穩(wěn)定狀態(tài),但當(dāng)外界有毒物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后,破壞動(dòng)物體內(nèi)的氧化—抗氧化系統(tǒng),產(chǎn)生過(guò)多的自由基,機(jī)體內(nèi)有關(guān)酶性和非酶性抗氧化系統(tǒng)就會(huì)清除過(guò)多的自由基[17]。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化物酶,是抵御氧化應(yīng)激的第一道防線(xiàn)。超氧化物歧化酶是保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分[18],它的作用原理是催化超氧化物自由基成為過(guò)氧化氫,再在過(guò)氧化氫酶的作用下將過(guò)氧化氫還原為水。由圖5c、d可知,超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性呈先升后降的變化趨勢(shì),在24 h時(shí),超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性達(dá)最高值。這可能是由于肝臟是機(jī)體內(nèi)的主要解毒器官,甲苯咪唑含量也最高,所以產(chǎn)生的活性氧較多所致。此時(shí)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,清除體內(nèi)過(guò)多的自由基。在48 h時(shí)機(jī)體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性相對(duì)于24 h而言酶活性被抑制,這可能與過(guò)量的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[19]。過(guò)氧化氫酶的活性降低也可能是因?yàn)槌趸锲缁富钚越档蛯?dǎo)致的過(guò)氧自由基過(guò)多[20]。有研究報(bào)道,過(guò)多的超氧陰離子可以抑制過(guò)氧化氫酶的活性[21]。

    谷胱甘肽過(guò)氧化物酶也是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑,能清除機(jī)體中的過(guò)氧化氫和細(xì)胞膜中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能完整、增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗病的作用[22-23]。由圖5a可知,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楣入赘孰倪^(guò)氧化物酶在解毒的過(guò)程中活性受到了抑制。由圖7a、b可見(jiàn),口灌20 mg/kg甲苯咪唑后,超氧化物歧化酶基因的mRNA水平呈先下降后上升的趨勢(shì),這可能是因?yàn)楦闻K中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性增加。Jin等[24]將小鼠長(zhǎng)期暴露于Pb中,小鼠的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶發(fā)生劑量依賴(lài)性降低,與本試驗(yàn)的結(jié)果類(lèi)似。堿性磷酸酶是機(jī)體在代謝或抗氧化過(guò)程中關(guān)鍵酶,是磷代謝重要酶類(lèi)之一,主要存在于骨骼、肝臟等地方,與生物體的成長(zhǎng)密切相連[25-26]。由圖5b可知,肝胰臟中堿性磷酸酶的活性呈先升后降的變化趨勢(shì)。在24 h時(shí)堿性磷酸酶活性達(dá)最高值,在48 h時(shí)堿性磷酸酶活性相較24 h時(shí)下降,這提示了肝胰臟中的堿性磷酸酶活性受甲苯咪唑的含量和給藥的時(shí)間影響。先升后降的趨勢(shì)是動(dòng)物對(duì)毒物的反應(yīng)形式,即拋物線(xiàn)形式;拋物線(xiàn)頂點(diǎn)是動(dòng)物對(duì)毒物的最大反應(yīng)值[27]。在24 h時(shí),異育銀鯽肝胰臟中的甲苯咪唑含量最高,這使得24 h堿性磷酸酶的活性相較于0、48 h而言最高。

    谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是動(dòng)物體內(nèi)重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶,其活性變化也反映肝細(xì)胞受損的情況。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于細(xì)胞漿中,谷草轉(zhuǎn)氨酶則主要存在于線(xiàn)粒體中[28-29],在血清中的含量很少,當(dāng)肝臟受損時(shí),細(xì)胞漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)釋放到血液中,血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性增加[12]。由圖6a、6b可知,血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化趨勢(shì)是先升后降。在24 h時(shí)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性最高,這可能是因?yàn)樵?4 h時(shí),肝臟中的甲苯咪唑含量最高,肝細(xì)胞受損比較嚴(yán)重,細(xì)胞漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液中,使血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性升高。這與盧敬讓等[30]的研究結(jié)果類(lèi)似。在48 h時(shí)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性相較24 h時(shí)下降,較0 h時(shí)上升。這可能是因?yàn)?8 h時(shí)肝胰臟中的甲苯咪唑被代謝掉,毒性相較24 h時(shí)降低了,所以此時(shí)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性低于24 h時(shí),但要高于0 h時(shí)。本試驗(yàn)結(jié)果提示,不應(yīng)長(zhǎng)期使用甲苯咪唑防控寄生蟲(chóng),需要在藥物使用后進(jìn)行藥物保肝處理;在肝膽綜合征和鯽皰疹病毒并發(fā)期應(yīng)慎用甲苯咪唑。

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