循環(huán)腫瘤細胞與泌尿系腫瘤關(guān)系的研究進展*

熊波波，張勁松，李寧，王海峰，左毅剛，王劍松

[昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院(云南省泌尿外科研究所) 泌尿外科，云南 昆明 650101]

惡性腫瘤是全世界發(fā)病率和病死率最高的疾病之一[1]。雖然目前的診斷和治療使患者病死率降低，但癌癥轉(zhuǎn)移后仍然無法治愈，癌癥轉(zhuǎn)移患者的比例≥90%[2]。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTC）可能是癌癥轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的重要危險途徑。越來越多的數(shù)據(jù)顯示，血液里存在的CTC 與癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3]。泌尿系腫瘤診斷基本以影像學(xué)檢測為準(zhǔn)，微小病灶無法識別，因此，CTC 有望成為泌尿系腫瘤早期診斷、治療及預(yù)后預(yù)測等有價值的生物標(biāo)志物。

1 CTC 生物學(xué)

CTC 是在1 例乳腺癌死亡患者的血液中被發(fā)現(xiàn)的一種類似癌癥細胞的細胞，當(dāng)時認為CTC 可能來源于原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶的乳腺癌細胞，并探索CTC 與癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)系[4]。盡管自CTC 已發(fā)現(xiàn)約150年，但在20 世紀(jì)90年代中期前，很少有研究關(guān)注CTC，當(dāng)時因技術(shù)落后，研究一直無進展。隨著醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、生物學(xué)、材料科學(xué)及化學(xué)等多學(xué)科研究的發(fā)展和研究者的不斷努力，特別是在過去的10年，CTC 已成為研究領(lǐng)域熱點[5]。

在通過循環(huán)血液轉(zhuǎn)移到遠處部位期間，癌細胞需進行一系列的血管內(nèi)移位-外滲-定植；一旦進入循環(huán)，CTC 必須經(jīng)受循環(huán)的剪切和免疫壓力。為適應(yīng)生存，CTC 需要通過一些保護機制來成功地并入新組織內(nèi)[6]。一種廣泛使用的理論是CTC 必須經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）才能侵入，這種表型轉(zhuǎn)變伴隨著分子變化，使上皮細胞變得更具有侵襲性、運動性，并且能夠播種遠距離位點。CTC 面臨的一些物理障礙可以通過EMT 來解決，例如EMT 細胞下調(diào)E-鈣黏蛋白，使其能夠從鄰近的上皮細胞分離，并上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）活性，其通過局部細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc, ECM）的導(dǎo)航而進入微血管系統(tǒng)[7]。具有間充質(zhì)特征的CTC 能預(yù)測許多癌癥的不良結(jié)果，表明這種表型轉(zhuǎn)變在循環(huán)/遠處轉(zhuǎn)移中占有優(yōu)勢[8]。

在癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)CTC 簇，其由2 ～50 個細胞組成，較循環(huán)中的單個細胞少。通過各種技術(shù)在幾種癌癥組織中檢測到更大的簇，也稱為腫瘤微栓子，并且循環(huán)中存在這些微栓子通常與肺癌和乳腺癌預(yù)后非常差相關(guān)[9]。簇中的細胞顯示細胞凋亡缺乏，這有助于避免其失巢凋亡；在外滲時，群集內(nèi)的自分泌信號傳導(dǎo)可促進其對遠端器官新環(huán)境的快速適應(yīng)[10]。CTC 簇還可能含有來自原發(fā)部位的正常細胞，例如基質(zhì)細胞，這對種子和土壤假說具有重要意義，帶來自身的土壤應(yīng)該只能增強種子在遠處發(fā)芽的能力。另外血小板還以多種方式維持血液中的CTC 簇[11]。

炎癥特別是慢性炎癥起促進CTC 轉(zhuǎn)移的作用，白細胞介素-37（Interleukin-37, IL-37）是抗炎因子，能抑制多個促炎因子的表達。B16F1 細胞可誘導(dǎo)體內(nèi)的炎癥，用B16F1 接種肺癌的小鼠體內(nèi)IL-37 表達導(dǎo)致B16F1 小鼠肺轉(zhuǎn)移下降，并伴有B16F1 誘導(dǎo)的炎癥抑制，說明炎癥是癌癥轉(zhuǎn)移所必需的，并且IL-37 可以通過抑制癌癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)來有效地抑制癌癥轉(zhuǎn)移[12]。

CTC 的富集與分離有利于其分子和功能特征的探索，為確定CTC 存在的全部信息，實驗室進行DNA、RNAji 蛋白分析[9]。使用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和陣列比較基因組雜交技術(shù)來研究染色體重排或CTC基因拷貝數(shù)的變化，下一代DNA 測序可以研究CTC 中的全基因組突變譜、CTC 和轉(zhuǎn)移瘤之間的突變譜，不僅揭示轉(zhuǎn)移的驅(qū)動突變，而且發(fā)現(xiàn)CTC 特異性突變，這些CTC 特異性突變實際上也存在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的亞克隆中[6]。通過個性化的CTC 分析，可以復(fù)制來自原發(fā)或轉(zhuǎn)移部位的CTC 分子發(fā)育的進化，從而可以檢測不常見的耐藥克隆[7]。CTC 的生物學(xué)研究可以有助于癌癥管理，從癌癥或癌癥治療過程中分離CTC 獲得的信息可為患者提供個體化的治療方法，也是癌癥精準(zhǔn)治療的思路之一。

2 CTC 的檢測

1959 最早報道過濾和沉淀檢測CTCs 的方法[13]，1964年報道二維微濾系統(tǒng)微觀過濾CTC 分離方法[14]，1998年報道的免疫磁性分離方法是最常用的檢測技術(shù)[15]，2004 報道的CellSearch 系統(tǒng)是美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration, FDA）批準(zhǔn)上市、用于檢測CTC 的第一產(chǎn)品，其尚未被醫(yī)學(xué)界廣泛接受，其原因為[16]： ①CellSearch 系統(tǒng)（設(shè)備）相當(dāng)昂貴；②每個樣品的檢測成本很高，因為需要抗體來捕獲血液中的CTC；③檢測過程需要復(fù)雜的濃縮步驟；④每個樣品的檢測時間長；⑤捕獲的CTC 純度非常低；⑥不能分離出CTC 用于表型鑒定和分子分析；⑦敏感性和特異性低。由于這些問題，CellSearch 可能在不久的將來過時[17]。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)40 多種用于CTC 檢測的技術(shù)[18]。

CTC 的檢測過程包括捕獲、富集、檢測及釋放4 個階段[19]： ①捕獲主要是指CTC 細胞表面表達的特異性生物標(biāo)志物，例如EpCAM 和CD45 來捕獲細胞；②富集是指CTC 的分離，目前方法包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、熒光顯微鏡、熒光Spectro photometery、光學(xué)顯微鏡、表面增強拉曼散射、流式細胞儀、正負濃縮技術(shù)、四氯化碳濃縮技術(shù)、三維微濾技術(shù)、慣性聚焦、直接成像及電化學(xué)方法；③檢測包括Pt@Ag 納米花（Pt@AgNFs）和AuNP/乙炔黑納米材料、微流體技術(shù)、量子點及金納米顆粒作為信號探針的檢測方法；④釋放富集的CTC 用于進一步表型鑒定和分子分析[18]。目前，CTC 檢測的理想方法是根據(jù)細胞大小進行分離和捕獲；另外就是通過體外培養(yǎng)來區(qū)分惡性和良性細胞[7]。

CTC 面臨的2 個主要挑戰(zhàn)： ①外周血中CTC 含量低。估計每1 ml 全血含有約1×109個無核紅細胞、1×107個有核血細胞及1×108個血小板，每7.5 ml 全血僅有1 ～10 個CTC，在如此龐大的血細胞中檢測CTC 是一項重大挑戰(zhàn)；②白細胞污染。CTC 與白細胞間的大小和生物特征重疊可能導(dǎo)致白細胞污染，從而降低純度[6]。為解決第1 個問題，目前可設(shè)計新結(jié)構(gòu)或顆粒以同時捕獲CTC 以放大檢測信號，以及使微芯片能夠同時捕獲和檢測單個CTC 和CTC 簇。為解決白細胞污染問題，主要有無標(biāo)簽和基于標(biāo)簽的方法： 一種方法是基于細胞特征擴大CTC 的大??；另一種方法是基于親和力結(jié)合將CTCs 與某些顆粒組合來擴大尺寸[20]。

3 前列腺癌

前列腺癌是男性第2 常見的癌癥，并且是全球癌癥相關(guān)死亡的第5 大原因[21]。目前選擇最合適的前列腺癌治療方法是基于Glenaon 評分和血清前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen, PSA）的治療，PSA的低特異性眾所周知，其在良性前列腺增生、感染等多種情況下也會出現(xiàn)PSA 升高，對療效判定的準(zhǔn)確性較低，不適合用于治療監(jiān)測[22]。另外，主動監(jiān)測的患者需要重復(fù)前列腺活檢以確定疾病進展，然而經(jīng)直腸或經(jīng)會陰途徑的前列腺活檢是一種侵入性手術(shù)，血尿、便血、急性尿潴留、尿路感染及菌血癥等并發(fā)癥多發(fā)[23]。因此，為選擇合適的主動監(jiān)測指標(biāo)，需要更精確和侵入性更小的監(jiān)測前列腺癌生物標(biāo)志物。最近的一項薈萃分析表明，CTC 陽性表明預(yù)后不良，CTC計數(shù)是抵抗性前列腺癌患者存活率的潛在獨立預(yù)后因素[24]。因此，使用CTC 早期檢測藥物對特定治療的反應(yīng)，能有效避免復(fù)發(fā)。

目前，普遍認為CTC 在前列腺癌中具有早期腫瘤診斷、疾病復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移擴散監(jiān)測，以及生物腫瘤表征的運用前景，是代表前列腺癌的可靠實時生物標(biāo)志物[25]。因此，CTC 可用作前列腺癌患者預(yù)后、預(yù)測及臨床管理的理想生物標(biāo)志物。相關(guān)研究評估基線CTC水平的預(yù)后價值，在接受化學(xué)療法和雄激素受體信號抑制劑治療的患者，基線CTC 水平與轉(zhuǎn)移性患者的臨床結(jié)果存在關(guān)聯(lián)，治療后患者血液中的CTC 水平降低與較長的總生存期相關(guān)。通過觀察PSA 水平和影像學(xué)的改變[26-27]表明CTC 的變化早于PSA 的變化，體現(xiàn)CTC 監(jiān)測前列腺癌療效的有效性和準(zhǔn)確性。

升高的外周血液CTC 水平（≥5 個細胞/7.5 ml）在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration resistant prostate cancer, mCRPC）中傳遞陰性預(yù)后。VOGELZANG 等[28]在MAINSAIL 實驗中評估208 例患者對CTC 計數(shù)（基線或治療后）、總生存期與多西紫杉醇治療后的反應(yīng)有關(guān)聯(lián)，結(jié)果在87 例（42%）患者中基線CTC＜5 個細胞/7.5 ml 血液，在121 例（58%）患者中≥5 個細胞/7.5 ml，CTC 計數(shù)≥5 個細胞/7.5 ml 與較低的總生存期相關(guān)。3 個周期后，CTC 從＜5 個細胞/7.5 ml 增加到≥5 個細胞/7.5 ml，縮短總生存期。而CTC 從≥5 個細胞/7.5 ml 減少到＜5 個細胞/7.5ml 與最佳預(yù)后相關(guān)。

來自mCRPC 患者的CTC 中雄激素受體剪接變體-7（androgen receptor splice variant-7, AR-V7） 與對阿比特龍和恩雜魯胺的抗性相關(guān)，然而卡巴他賽可能對AR-V7陽性患者有效。ONSTENK 等[29]研究卡巴他賽對mCRPC 患者的藥效學(xué)影響，并使用CellSearch 系統(tǒng)計算CTC。29 例患者中16 例（55%）檢測到AR-V7，其中基線7.5 ml 血液中≥10 個CTC的患者占100%，發(fā)現(xiàn)CTC 中AR-V7 的存在與無進展生存期無關(guān)，所以對卡巴他賽的反應(yīng)似乎與mCRPC患者CTCs 的AR-V7 狀態(tài)無關(guān)。因此卡巴他賽可能是AR-V7 陽性CTC 患者的有效治療選擇。

在一項Ⅲ期臨床研究中，mCRPC 患者用多西紫杉醇與來那度胺化療3 個周期后的CTC 水平升高，預(yù)測存活率較低[28]。SCHER 等[27]的Ⅲ期實驗報道，全血中乳酸脫氫酶水平和CTC 數(shù)量是醋酸阿比特龍和多西紫杉醇治療mCRPC 患者總生存期的預(yù)測因子，CTC ≥5 個細胞/7.5 ml 患者的2年生存率為2%，而CTC＜5 個細胞/7.5 ml 患者2年生存率為46%（CTC在12 周時計數(shù)）。LORENTE 等[30]研究表明，在初始計數(shù)CTC ≥5 個細胞/7.5 ml 治療后，CTC 計數(shù)下降30%與化療和阿比特龍治療后mCRPC 患者的總生存期相關(guān)。THALGOTT 等[31]提出，CTC 計數(shù)似乎是生存和治療反應(yīng)的早期且更敏感的預(yù)測因子，并且可以為個體化治療策略提供補充信息。

一些研究表明，根治性前列腺切除術(shù)后CTC 與生化復(fù)發(fā)有關(guān)。在250 例前列腺癌高?；颊叩难芯恐校庵苎星傲邢俑杉毎乖╬rostate stem cell antigen,PSCA）mRNA 的表達是根治性前列腺切除術(shù)后生化復(fù)發(fā)的重要預(yù)測指標(biāo)[32]。JEFFERS 等[33]報道，外周血前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen, PSMA）mRNA 是根治性前列腺切除術(shù)后生化復(fù)發(fā)的預(yù)測因子，檢測外周血中含有PSMA mRNA 細胞的方式是通過RT-PCR 檢測CTC。

總體而言，CTC 的計數(shù)和表征已顯示出對轉(zhuǎn)移性和晚期前列腺癌患者預(yù)后和預(yù)測的強大潛力；同時CTC 檢測和表征已顯示出監(jiān)測癌癥治療和指導(dǎo)精確癌癥治療的優(yōu)勢。然而CTC 分子譜需要進一步的研究和探索，需要更大型臨床實驗來證實其臨床效用。

4 膀胱癌

膀胱癌是世界上最常見的癌癥之一，分為非肌肉侵入性膀胱癌（non-muscle invasive carcinoma of bladder, NMIBC）和肌肉浸潤膀胱癌（muscle invasive carcinoma of bladder, MIBC）。NMIBC 經(jīng)常復(fù)發(fā)并進展為MIBC，存活率降低且遠處轉(zhuǎn)移頻繁。通過膀胱鏡檢查和活體組織標(biāo)本病理檢查診斷膀胱癌，這通常伴不良反應(yīng)，因此迫切需要開發(fā)用于MIBC 和NMIBC 的初始檢測和監(jiān)測的新型診斷方法。美國FDA 批準(zhǔn)用于膀胱癌檢測的尿液監(jiān)測是可行的，但是尿液測定的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性仍然不理想[2]。為尋求新的分子標(biāo)志物和多種測定法，使用微創(chuàng)液體活檢來識別膀胱癌中的生物標(biāo)志物效果佳。血液中基于CTC 的標(biāo)志物在預(yù)后、預(yù)測及監(jiān)測膀胱癌方面是有希望的潛在標(biāo)志物[34]。

CTC 可作為NMIBC 患者危險分層的預(yù)后標(biāo)志物，可預(yù)測復(fù)發(fā)和進展。BUSETTO 等[35]研究155 例經(jīng)病理證實診斷為高風(fēng)險NMIBC 的患者，進行CTC 評估后接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，101 例患者（A 組）用CellSearch 自動化系統(tǒng)分析，54 例患者（B 組）用CELLection Dynabeads 手動系統(tǒng)分析，結(jié)果隨訪28 個月，共65 例（41.9%）復(fù)發(fā)，27 例（17.4%）疾病進展，9 例（5.8%）淋巴結(jié)或骨轉(zhuǎn)移。筆者的CTC 分析中，A 組20 例（19.8%）陽性，B 組24 例（44.4%），發(fā)現(xiàn)CTC 與首次復(fù)發(fā)時間有相關(guān)性。筆者觀察到75% CTC陽性患者（A 組）和83% CTC 陽性患者（B 組）復(fù)發(fā)率、進展時間也與CTC 密切相關(guān)，A、B 組CTC 患者進展率分別為65%和29%。ZHANG 等[36]一項薈萃分析也提出，外周血中CTC 的存在是尿路上皮癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)，其還可以用作確認癌癥診斷的非侵入性方法。

CTC 是根治性膀胱切除術(shù)（radical cystectomy,RC）治療尿路上皮癌患者預(yù)后的獨立危險因素，術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險更高。SOAVE 等[37]的一項非隨機前瞻性研究中，226 例尿路上皮癌患者行RC 治療，術(shù)前獲得所有患者血液樣本，并使用CellSearch 系統(tǒng)分析CTC，50 例患者（27%）給予鉑類輔助化療，185 例患者可用于分析，其中41 例患者（22.2%）出現(xiàn)CTC，結(jié)果在31 個月的中位隨訪期間，CTC 的存在與無輔助化療給藥患者的疾病復(fù)發(fā)和總體死亡率相關(guān)。在接受輔助化療的患者中，有或無CTC 的患者比較無差異。在未化療患者的多變量分析中，CTC 的存在是疾病復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子；同時另外有研究指出，CTC 決定RC 術(shù)后是否需要輔助化療，認為臨床非轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者接受RC 治療時存在CTC 是不良預(yù)后的有力預(yù)測指標(biāo)，可能對輔助化療決策和監(jiān)測有用，但是目前證據(jù)有限，因此強烈建議將CTC 整合到未來的UCB 臨床實驗中[38]。

程序性死亡受體-1（programmed death-1, PD-1）和程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）檢查點抑制劑在一部分晚期膀胱癌患者中具有 活 性。ANANTHARAMAN 等[39]從MIBC 和25 例轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者中分離CTC 的PD-L1 蛋白，發(fā)現(xiàn)在MIBC 和轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者中均可檢測到CTC，在mBCa 患者中，CK+和CK-的CTC 均有PD-L1 表達。該研究結(jié)果表明通過微創(chuàng)過程識別晚期膀胱癌患者CTCs 的PD-L1 表達，可能具有指導(dǎo)檢查點抑制劑免疫療法的潛力，

5 腎癌

EpCAM 是一種表達于腎癌CTC 的上皮細胞表面蛋白，作為特異性標(biāo)志物，可用于檢測腎癌的CTC，但只有少數(shù)腎腫瘤表達EpCAM，故關(guān)于腎癌的CTC研究報道較少。然而，目前不斷探索其他的腎癌特異性標(biāo)志物來替代EpCAM，以提高對腎癌CTC 的檢測[40]。見表1。研究發(fā)現(xiàn)，晚期腎癌患者的血CTC 水平升高，并且與更具攻擊性的表型相關(guān)[41]。循環(huán)腎癌細胞能夠預(yù)測當(dāng)前和未來的轉(zhuǎn)移，還發(fā)現(xiàn)外周血中CTC 的水平與腎癌中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)。除CTC波形蛋白表達狀態(tài)外，還發(fā)現(xiàn)外周血中CTC 的計數(shù)與腎癌進展相關(guān)[42]。BAI 等[43]對腎癌患者外周血進行CellSearch 系統(tǒng)和上皮腫瘤細胞大小的分離，以研究CTC 的臨床意義，發(fā)現(xiàn)腎癌患者中CTC 的存在與較高的臨床分期相關(guān)，表明CTC 的存在可能是腎癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。目前關(guān)于CTC 在腎癌預(yù)后及檢測方面研究較少，但通過以上的研究發(fā)現(xiàn)CTC 仍可以作為腎癌患者預(yù)后的有效標(biāo)志物，但需更多的臨床研究分析。

6 CTC 作為預(yù)后和臨床管理的理想標(biāo)志物

個性化癌癥醫(yī)學(xué)需要開發(fā)腫瘤特異性生物標(biāo)志物以優(yōu)化靶向療法的選擇，同時更好地評估對治療的反應(yīng)。CTC 異質(zhì)性作為生物標(biāo)志物開發(fā)是一項令人期待的研究，相當(dāng)于提供腫瘤的識別指紋。盡管CTC 在血液中稀有，但表型多樣性和異質(zhì)性；同時獲得方式為無創(chuàng)簡單，讓CTC 可以作為泌尿系腫瘤診斷、預(yù)后及評估治療效果的理想生物標(biāo)志物。為提高CTC 生物標(biāo)志物的精準(zhǔn)度，可結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的不同分子表型，結(jié)合臨床相關(guān)信息，以指導(dǎo)基于個體患者疾病的分子特征的治療選擇。目前正在進行的臨床研究，前瞻性地闡明基于CTC 的分子標(biāo)志物在預(yù)測患者反應(yīng)和促進精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代方面的作用。然而，基于液體活檢的預(yù)測評估臨床效用仍然需要通過臨床試驗來解決。總之，CTC 分析可以提供關(guān)于腫瘤生物學(xué)的重要信息，有可能提高治療的質(zhì)量和功效，最終目標(biāo)是提高患者的生存率。見表1。

表1 泌尿系腫瘤相關(guān)CTC 相關(guān)生物標(biāo)志物

7 總結(jié)與展望

隨著新的靶向和免疫療法的出現(xiàn)，癌癥治療的進展將繼續(xù)擴大，同時強調(diào)精確和個性化治療。伴隨微創(chuàng)的液體活檢技術(shù)的出現(xiàn)，可能取代傳統(tǒng)活體組織檢查或切除標(biāo)本。CTC 提供獲得關(guān)于癌癥的重要分子和細胞信息，提供實時預(yù)后和預(yù)測信息，有可能指導(dǎo)治療決策。CTC 還具有基于細胞和功能的研究的獨特優(yōu)勢，可以提供關(guān)于癌癥轉(zhuǎn)移過程的有價值的信息，包括CTC 的產(chǎn)生，他們在血液中的存活，以及與血液成分的相互作用，這些研究將繼續(xù)增加人們對轉(zhuǎn)移過程的了解。研究人員希望通過連續(xù)血液抽取對泌尿系腫瘤的CTC 分析運用到臨床： ①確定患者預(yù)后；②實時監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)和治療反應(yīng)來改變癌癥治療的當(dāng)前狀況；③識別新的治療靶點；④闡明耐藥機制；⑤改善筆者目前對腫瘤進展和轉(zhuǎn)移性疾病的理解。