白芍總苷對大鼠球囊損傷再狹窄的作用及機(jī)制研究*

羅特丹，姜昕，周沖沖，李鵬

（深圳市人民醫(yī)院 老年病科，廣東 深圳 518020）

隨著中國老齡化程度的加速，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞喎Q冠心?。┑幕疾÷始安∷缆手鹉暝黾?。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）通過開通狹窄冠狀動脈能明顯降低冠心病患者的病死率，改善預(yù)后，因此在臨床中得到廣泛的應(yīng)用，但發(fā)生術(shù)后再狹窄仍然是影響PCI 療效的重要原因。有研究表明，PCI 造成損傷血管局部炎癥反應(yīng)是術(shù)后再狹窄的根本原因，而Th17 和Treg 細(xì)胞免疫失衡引起的炎癥失控在多種疾病中扮演著重要角色，但是否在再狹窄的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用尚無相關(guān)報(bào)道[1-3]。白芍總苷作為臨床中被廣泛應(yīng)用的非特異性抗炎藥能否通過調(diào)節(jié)Th17 和Treg 細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抑制PCI 術(shù)后再狹窄的作用亦無相關(guān)研究。如今藥物涂層球囊在PCI 中占據(jù)一席之地，有研究顯示，藥物球囊與第二代洗脫支架相比在治療再狹窄方面無明顯區(qū)別[4]。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過復(fù)制大鼠頸動脈球囊損傷模型，應(yīng)用藥物浸泡球囊方法模擬藥物涂層球囊，研究白芍總苷干預(yù)前后Th17、Treg 細(xì)胞數(shù)量及內(nèi)膜的變化，為治療再狹窄尋找新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑

SPF 級14 ～16月齡雄性SD 大 鼠[SCXK（粵）2019-0035]36 只由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Th17 和Treg 細(xì)胞檢測試劑盒購自美國eBioscience 公司，白芍總苷購自寧波立華制藥有限公司（批號： H20055058）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)制大鼠頸動脈球囊損傷模型36 只大鼠被隨機(jī)、等量分成對照組、球囊損傷組、白芍總苷浸泡球囊組及白芍總苷灌胃組，每組9 只。各組大鼠模型復(fù)制前4 d 用生理鹽水灌胃，20 ml/d，白芍總苷灌胃組用200 mg/（kg·d）白芍總苷生理鹽水灌胃，20 ml/d。各組大鼠模型復(fù)制前12 h 皮下注射低分子肝素，球囊浸泡組的球囊浸泡于5 g/L 白芍總苷生理鹽水4 h。各組術(shù)前麻醉后，在左頸總動脈靠心臟一端阻斷血流，切開頸外動脈。對照組做假手術(shù)，只結(jié)扎頸外動脈再縫合切口。其余組復(fù)制球囊損傷模型： 用規(guī)格2.0 mm×10.0 mm 的Medtronic 球囊導(dǎo)管從切口處插入至頸總動脈約1.5 cm，用200 kPa 壓力充盈球囊，向遠(yuǎn)離心臟一端拖拉導(dǎo)管，剝脫動脈內(nèi)膜，抽除氣體后，再送向近心臟一端，如此重復(fù)3 次，移去導(dǎo)管，結(jié)扎切口，去掉頸總動脈血管夾，恢復(fù)阻斷血流，縫合傷口。術(shù)后24 h 再次皮下注射低分子肝素預(yù)防血栓。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素3 d 預(yù)防感染。術(shù)后白芍總苷灌胃組用200 mg/（kg·d）白芍總苷生理鹽水灌胃，20 ml/d，共13 d，其余組用生理鹽水灌胃，20 ml/d，共13 d。模型復(fù)制過程中由于損傷嚴(yán)重死亡5 只，標(biāo)本取材時(shí)因發(fā)現(xiàn)血栓導(dǎo)致頸總動脈栓塞而剔除1只。最終納入實(shí)驗(yàn)共30只，對照組、球囊損傷組、白芍總苷灌胃組及白芍總苷浸泡球囊組分別為9、6、7 和8 只。

1.2.2 指標(biāo)檢測①標(biāo)本取樣： 術(shù)后14 d，在麻醉下取各組大鼠左頸總動脈球囊損傷部位，長度約1.5 cm，以2 根血管作為1 個樣本。取0.5 cm 長的損傷血管置于4%多聚甲醛中固定，制成石蠟標(biāo)本。每個標(biāo)本按距心臟近、中及遠(yuǎn)端連續(xù)切4μm 厚的切片10 張，蘇木精-伊紅染色后，用顯微鏡觀察動脈管腔變化。取大鼠脾臟用于流式細(xì)胞儀分析。②病理學(xué)檢測血管內(nèi)膜變化： 應(yīng)用Quantiment 520 型計(jì)算機(jī)圖像分析儀分別測量各組血管的管腔、內(nèi)膜及中膜橫斷面面積[5]。③流式細(xì)胞儀檢測Th17、Treg 細(xì)胞分別占CD4+T 細(xì)胞的百分比： 無菌分離大鼠脾臟，使用無菌注射器活塞部分研磨脾臟，細(xì)胞過濾器上過濾，離心后去上清，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107個/ml，將100μl 細(xì)胞懸液加入流式管中，標(biāo)記細(xì)胞外標(biāo)熒光抗體（CD3 PE-Cy5、CD4-FITC 及CD25 PE-CY5.5），混勻后4℃避光孵育30 min，加染色緩沖液2 ml 后離心洗滌2 次，棄上清液，加入固定穿膜液1 ml 后4℃避光孵育30 min 進(jìn)行穿膜。加入穿膜緩沖液2 ml 離心洗滌2 次后棄上清，加入流式內(nèi)標(biāo)熒光抗體（PE標(biāo)記的Foxp3，APC-CY7 標(biāo)記的IL-17A）4℃避光孵育30 min，用穿膜緩沖液洗2 ml 離心洗滌2 遍后棄上清，加入染色緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測并分析Th17（CD3+CD4+IL-17A+）及Treg（CD4+CD25+Foxp3+）的比例，應(yīng)用Flowjo 7.6.1 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組主動脈內(nèi)膜增生程度比較

各組管腔面積、內(nèi)膜面積及內(nèi)膜面積/中膜面積比值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組內(nèi)膜光滑無增厚，僅由一層扁平的血管內(nèi)皮細(xì)胞組成；球囊損傷組新生內(nèi)膜形成導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，新生內(nèi)膜主要由大量增殖的血管平滑?。╲ascular smooth muscle, VSM）細(xì)胞構(gòu)成，增生的VSM 細(xì)胞排列無序紊亂，管腔面積較對照組小，內(nèi)膜面積及內(nèi)膜面積/中膜面積比值較對照組大（P＜0.05）；白芍總苷灌胃組新生內(nèi)膜較球囊損傷組薄，管腔狹窄程度較球囊損傷組明顯減輕，管腔面積較球囊損傷組大，內(nèi)膜面積及內(nèi)膜面積/中膜面積比值較球囊損傷組小，但高于對照組（P＜0.05）。白芍總苷浸泡球囊組內(nèi)膜較白芍總苷灌胃組薄，增生的VSM 細(xì)胞較白芍總苷灌胃組少，管腔面積較白芍總苷灌胃組大，內(nèi)膜面積及內(nèi)膜面積/中膜面積比值較白芍總苷灌胃組小，但高于對照組（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組主動脈內(nèi)膜增生程度比較 （±s）

表1 各組主動脈內(nèi)膜增生程度比較 （±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與球囊損傷組比較，P ＜0.05。

組別 n 管腔面積/mm2 內(nèi)膜面積/mm2 中膜面積/mm2 內(nèi)膜面積/中膜面積對照組 9 0.846±0.012 0.033±0.028 0.343±0.013 0.085±0.011球囊損傷組 6 0.472±0.016① 0.481±0.017① 0.331±0.013① 1.436±0.048①白芍總苷灌胃組 7 0.634±0.014①② 0.254±0.015①② 0.343±0.021①② 0.753±0.014①②白芍總苷浸泡球囊組 8 0.735±0.016①② 0.188±0.012①② 0.363±0.015①② 0.543±0.033①②F 值 5.741 4.853 1.165 4.519 P 值 0.008 0.017 0.133 0.022

圖1 各組頸動脈球囊損傷后的病理切片 （HE 染色×400）

2.2 各組Th17、Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比及Th17/Treg 比較

各組Th17、Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比及Th17/Treg 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。球囊損傷組Th17 占CD4+T 細(xì)胞的百分比、Th17/Treg 高于白芍總苷灌胃組、白芍總苷浸泡球囊組及對照組（P＜0.05）；且白芍總苷浸泡球囊組低于白芍總苷灌胃組，而高于對照組（P＜0.05）。白芍總苷灌胃組Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比高于球囊損傷組及對照組（P＜0.05），且白芍總苷浸泡球囊組高于白芍總苷灌胃組（P＜0.05）。見表2和圖2、3。

表2 各組Th17、Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比及Th17/Treg 比較 （%，±s）

表2 各組Th17、Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比及Th17/Treg 比較 （%，±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與球囊損傷組比較，P ＜0.05；③與白芍總苷灌胃組比較，P ＜0.05。

組別 n Th17 占CD4+ T 細(xì)胞百分比 Treg 占CD4+ T 細(xì)胞百分比 Th17/Treg對照組 9 0.27±0.05 0.33±0.06 0.79±0.10球囊損傷組 6 1.24±0.07① 0.52±0.07① 2.52±0.12①白芍總苷灌胃組 7 1.02±0.06①② 0.88±0.08①② 1.28±0.08①②白芍總苷浸泡球囊組 8 0.87±0.06①②③ 1.05±0.08①②③ 0.91±0.11①②③F 值 5.274 4.526 4.381 P 值 0.018 0.023 0.026

圖2 各組大鼠脾臟中Th17 細(xì)胞比例

圖3 各組大鼠脾臟中Treg 細(xì)胞比例

3 討論

PCI 術(shù)后血管再狹窄的過程實(shí)質(zhì)上是血管對損傷所致炎癥反應(yīng)的修復(fù)過程，PCI 所致局部內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙誘發(fā)的炎癥反應(yīng)釋放多種炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)VSM 細(xì)胞分化、增生并向損傷部位移行，使血管重建最終導(dǎo)致再狹窄，因此可以認(rèn)為炎癥是再狹窄的始發(fā)因素[6]。

有研究顯示，各種導(dǎo)致動脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素均可引起血管內(nèi)Th17 細(xì)胞的增加，由Th17 細(xì)胞分泌的IL-17A 能介導(dǎo)白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮之上，最終促進(jìn)炎癥的發(fā)展[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷能通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）途徑引起IL-17A 的大量分泌，并作用于VSM 細(xì)胞，致使球囊損傷后局部管腔狹窄，間接表明Th17 細(xì)胞增多在再狹窄中占有重要的地位[5]。筆者發(fā)現(xiàn)球囊損傷后損傷血管內(nèi)膜面積與Th17 細(xì)胞比例相關(guān)，表明球囊損傷可使Th17 細(xì)胞數(shù)量增加并促進(jìn)VSM 細(xì)胞向損傷部位的遷移及增殖，最終引起管腔狹窄。其機(jī)制可能是局部損傷所致Th17 細(xì)胞大量激活，Th17 通過NF-κB 途徑引起IL-17A、IL-6 等促炎因子的分泌，產(chǎn)生局部炎癥瀑布，使炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大，最終導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚。

Treg 細(xì)胞是一類對慢性炎癥疾病具有重要保護(hù)作用的T 細(xì)胞亞群，能通過分泌如IL-10 等抑制炎癥的細(xì)胞因子及抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的增殖，達(dá)到抑制炎癥的效果[10]。Treg 細(xì)胞可通過抗巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥活性而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展[11]。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，動脈粥樣硬化性疾病與各種信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑引起Th17/Treg 細(xì)胞失衡相關(guān)[12-13]。而Th17/Treg 失衡，將導(dǎo)致免疫失衡，并引起一系列炎癥反應(yīng)。筆者發(fā)現(xiàn)球囊損傷后Treg 細(xì)胞比例較對照組明顯增加，且Treg 細(xì)胞比例與球囊損傷后管腔面積相關(guān)，考慮球囊損傷引起局部炎癥，機(jī)體通過上調(diào)Treg 細(xì)胞比例抑制IL-6 等炎癥因子進(jìn)一步產(chǎn)生，并促進(jìn)IL-10 等抑炎因子的分泌，避免球囊損傷造成的炎癥反應(yīng)的級聯(lián)擴(kuò)大而抑制再狹窄。并且隨著炎癥的擴(kuò)大，通過負(fù)反饋機(jī)制使Treg 細(xì)胞激活增多，但由于Treg 細(xì)胞增多所產(chǎn)生的抑炎效果不足以完全抵消由于Th17 細(xì)胞增多所帶來的促炎效果，最終球囊損傷引起的局部炎癥反應(yīng)所致再狹窄仍不可避免發(fā)生，這從球囊損傷后Th17 細(xì)胞的變化幅度較Treg 細(xì)胞變化幅度大中得以證實(shí)。因此糾正球囊損傷后Th17/Treg 細(xì)胞失衡在阻止再狹窄的發(fā)生中具有重要意義。

白芍總苷是從中藥白芍中提取出的有效成份，是目前臨床廣泛應(yīng)用的一種免疫調(diào)節(jié)劑。有研究報(bào)道白芍總苷能通過抑制NF-κB 等通路減少Th17 細(xì)胞分化，最終減輕炎癥導(dǎo)致的臨床癥狀[14]。LIN 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能通過降低Foxp3基因啟動子區(qū)域甲基化水平及脫甲基作用，促進(jìn)Foxp3 的表達(dá)，提高Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞平衡達(dá)到治療炎癥性疾病的目的[16-17]。本研究中無論是應(yīng)用灌胃的方法使白芍總苷作用于全身，還是應(yīng)用球囊浸泡的方法使白芍總苷作用于局部，在降低球囊損傷后脾臟Th17 細(xì)胞水平的同時(shí)還能提高Treg 細(xì)胞水平，使Th17/Treg 降低，且Th17/Treg 與狹窄程度及VSM 細(xì)胞增生程度相關(guān)。提示白芍總苷能通過上述信號途徑負(fù)向調(diào)節(jié)球囊損傷后大鼠Th17/Treg 細(xì)胞平衡，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，達(dá)到抑制再狹窄的目的。本研究中白芍總苷上調(diào)Treg 細(xì)胞的能力較下調(diào)Th17 細(xì)胞明顯，可能是白芍總苷先通過上調(diào)Treg 細(xì)胞至一定程度后，再通過Th17/Treg 免疫系統(tǒng)負(fù)向調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞的分化。而且還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白芍總苷浸泡球囊的方法，同樣能調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡，以達(dá)到抑制球囊損傷后再狹窄的目的，且效果好于白芍總苷灌胃。結(jié)果提示可將白芍總苷作為藥物球囊涂層局部使用，其較全身使用能更好地抑制球囊損傷后的再狹窄，且無明顯不良反應(yīng)。考慮其原因?yàn)榫植渴褂冒咨挚傑蛰^全身使用時(shí)損傷部位白芍總苷濃度更高，故能更好地調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡而抑制炎癥。但無論應(yīng)用何種方法干預(yù)，對照組管腔面積最大，考慮白芍總苷雖然能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡減少炎癥的進(jìn)一步擴(kuò)大，但并不能完全消除炎癥引起的VSM 細(xì)胞增生。

目前已經(jīng)進(jìn)入藥物洗脫支架時(shí)代，但因支架的金屬網(wǎng)格殘留特點(diǎn)仍可導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生。且在多項(xiàng)研究中藥物洗脫支架仍有爭論，一項(xiàng)關(guān)于現(xiàn)階段使用的藥物洗脫支架安全性的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，對比金屬裸支架，藥物洗脫支架有更多的晚期血栓風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此無論從臨床上還是社會經(jīng)濟(jì)學(xué)方面考慮都迫切需要尋找一種新的藥物，以減少再狹窄的發(fā)生。白芍總苷或可作為球囊的藥物涂層應(yīng)用于PCI 術(shù)中，通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡，抑制炎癥介導(dǎo)的VSM 細(xì)胞的增殖及向損傷部位的遷移，減少支架內(nèi)內(nèi)膜增生，達(dá)到減少再狹窄發(fā)生的目的，因此期待通過大規(guī)模臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證白芍總苷作為藥物球囊的涂層，減少PCI 術(shù)后再狹窄的發(fā)生。