自體富血小板血漿促進(jìn)兔脛骨牽張成骨新骨形成的實(shí)驗(yàn)研究

湯麗國(guó)，任志勇，劉增運(yùn)，王輝，霍繼貞

（1.山東陽(yáng)光融和醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 262100；2.中國(guó)人民解放軍陸軍第80集團(tuán)軍醫(yī)院 創(chuàng)傷骨二科，山東 濰坊 261021）

富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）是自體全血通過(guò)離心、分離后得到的濃縮血小板，內(nèi)有含量豐富的血小板。血小板的主要作用是凝血，當(dāng)血小板被激活劑激活時(shí)，能釋放多種生長(zhǎng)因子，包括血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）和血小板源性血管生成因子（PDAF）等，它們共同參與組織修復(fù)。有研究報(bào)道稱PDGF與IGF能共同促進(jìn)骨再生。PRP的制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低，且在應(yīng)用過(guò)程中沒(méi)有排異性，目前在國(guó)內(nèi)外已有使用PRP來(lái)修復(fù)骨與軟組織損傷的大量報(bào)道，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)研究中均取得了顯著的療效[1-4]。但在大段骨缺損牽拉成骨中應(yīng)用PRP的效果并不確切，爭(zhēng)議不斷。我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探究不同時(shí)期應(yīng)用自體富血小板血漿在牽張成骨過(guò)程中對(duì)延伸區(qū)新骨形成質(zhì)量的影響，并為臨床在縮短牽張成骨過(guò)程中新生骨的礦化過(guò)程、加速骨愈合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

中國(guó)成年家兔（體重2.0～2.5 kg）共48只，雌雄不限，無(wú)差別飼養(yǎng)。隨機(jī)分A、B、C三組，每組16只，其中A、B組為實(shí)驗(yàn)組，分別在開始牽張和牽張結(jié)束后給予牽張間隙內(nèi)注射富血小板血漿（PRP）0.5 mL與激活劑（牛凝血酶、10% CaCl2）混合形成得膠樣物質(zhì)；C組作為空白對(duì)照不注射任何物質(zhì)。

1.2 動(dòng)物模型的制作

本模型所采用的骨延長(zhǎng)器為人掌骨所使用的雙邊外固定器，其延長(zhǎng)機(jī)理與Ilizarov外固定架相同。氯胺酮肌注麻醉，無(wú)菌條件下，自兔左側(cè)脛骨前內(nèi)側(cè)中上段作縱行切口，確定截骨平面為脛骨干骺端處，在截骨面上下各1.0cm處平行打入兩枚克氏針，安裝外固定架，線鋸截骨，在脛骨截骨平面以遠(yuǎn)約0.5 cm水平將腓骨楔形截骨，沖洗后刀口仔細(xì)縫合，無(wú)菌敷料包扎。術(shù)后第8天開始以1.0 mm/d速度延長(zhǎng)，分兩次完成，共牽拉10 d，總計(jì)長(zhǎng)度為1.0 cm，隨后即進(jìn)入固定期。其中A、B組分別在開始牽張和牽張結(jié)束后予牽張間隙內(nèi)注射富血小板血漿（PRP）0.5 mL與激活劑（牛凝血酶、10% CaCl2）混合而形成的凝膠樣物質(zhì)；C組正常牽張，不做其他處理。

1.3 PRP的制備

嚴(yán)格無(wú)菌消毒條件下，自兔耳中央動(dòng)脈取血，采用Landesberg法制備PRP[5]，用無(wú)菌注射器吸取0.5 mL PRP，將其與牛凝血酶、10% CaCl2混合形成的凝膠樣物質(zhì)注入截骨間隙內(nèi)。

1.4 觀察指標(biāo)

組織學(xué)檢查：固定期第35天在骨牽張間隙內(nèi)取材，觀察各組延長(zhǎng)間隙內(nèi)新生骨形成情況，檢測(cè)各組牽張成骨區(qū)骨形成、鈣鹽沉積及骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

骨密度測(cè)定：在牽張成骨固定期的第42天隨機(jī)取材，首先采用 Hologic Q DR-2000雙能X線骨密度儀（陸軍第80集團(tuán)軍醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心）測(cè)定牽張成骨區(qū)的骨密度。

扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：將測(cè)定骨密度的牽張成骨標(biāo)本用CSS-4000萬(wàn)能材料測(cè)試儀測(cè)量牽張區(qū)新生骨的最大扭矩、扭轉(zhuǎn)角；計(jì)算新生骨的抗扭強(qiáng)度及剛度：Tb(抗扭強(qiáng)度)=Mn(最大扭矩)/Wn(抗扭截面模量)，GJP(抗扭剛度)=Mn·l(長(zhǎng)度)/θ(扭轉(zhuǎn)角)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察

A組骨小梁密度較低，可見炎性細(xì)胞增多，少量的破骨細(xì)胞，其間被大量的纖維組織填充，成骨細(xì)胞數(shù)量較少。B組骨小梁布列較為緊密，纖維組織發(fā)育成熟，成骨細(xì)胞數(shù)量較其他組有所增多，可見哈弗斯管。C組骨小梁密度相對(duì)較低，有大量未成熟的纖維組織填充，炎性細(xì)胞成骨細(xì)胞數(shù)量較少（圖1）。

圖1 各組固定期第35天牽張間隙新生骨組織（HE染色×100）

2.2 骨密度測(cè)定

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)程序分析牽張成骨區(qū)新生骨骨密度測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果。各組骨密度數(shù)據(jù)行方差分析，兩組間配對(duì)行t檢驗(yàn)。PRP組的BMD相對(duì)值（%）明顯高于空白組（P＜0.05）；B組骨密度測(cè)定優(yōu)于C組（P＜0.05，表1)。

表1 三組骨密度測(cè)試結(jié)果比較（±s）

表1 三組骨密度測(cè)試結(jié)果比較（±s）

組別 BMD（g/cm2）A組 (PRP) 0.1005±0.027 B組 (PRP) 0.1319±0.033 C組 (空白組) 0.0799±0.029

2.3 生物力學(xué)測(cè)試

生物力學(xué)扭力測(cè)試結(jié)果顯示PRP組的測(cè)試數(shù)據(jù)優(yōu)于空白組（P＜0.05），而PRP組中B組載荷強(qiáng)度優(yōu)于C組（P＜0.05），B組載荷強(qiáng)度最大(表2)。

表2 三組扭力測(cè)試結(jié)果比較（±s）

表2 三組扭力測(cè)試結(jié)果比較（±s）

組別 Mn(kg·cm) Tb(g/mm2) GJP(gcm2/度) θ(度/cm)（最大扭矩） （抗扭強(qiáng)度） （抗扭剛度）（單位長(zhǎng)度扭轉(zhuǎn)角）A組 8.35±0.77 1501.94±14.73 3544.13±515.94 1.7025±0.25 B組 9.31±0.74 1517.22±10.67 4012.00±573.68 2.7088±0.24 C組 7.55±0.93 1497.22±13.77 2580.30±513.00 1.5325±0.43

3 討論

3.1 觀察背景

牽張成骨技術(shù) (distraction osteogenesis，DO)在修復(fù)各種原因造成的大段骨缺損以及正畸等方面得到大家的重視，臨床已經(jīng)比較成熟，但在治療過(guò)程中會(huì)存在各種并發(fā)癥，長(zhǎng)期外固定支架也會(huì)給患者心理造成一定創(chuàng)傷[6-8]。減少并發(fā)癥的一個(gè)有效途徑就是縮短牽張成骨新生骨的成骨時(shí)間，有效促進(jìn)新生骨的成骨質(zhì)量。當(dāng)前的研究表明，牽張成骨的結(jié)果受機(jī)械性以及生物性因素的影響，多種因子的調(diào)控在骨愈合過(guò)程中也起著至關(guān)重要的影響。

富血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)通過(guò)一些方法激活血小板，使得血小板顆粒釋放出多種生長(zhǎng)因子，其中包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等，它們都對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化及組織生長(zhǎng)有重要的作用，并可促進(jìn)組織血管形成，加快新生骨的血管化，促進(jìn)骨愈合。我們基于富血小板血漿的這些特性設(shè)計(jì)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，利用富血小板激活后釋放的多種因子促進(jìn)牽張成骨新生骨的礦化。

3.2 結(jié)果分析

在固定期第35天于骨牽張間隙內(nèi)取材，觀察各組延長(zhǎng)間隙內(nèi)新生骨形成情況。HE染色結(jié)果顯示PRP組延長(zhǎng)區(qū)的骨小梁較空白組排列更為緊密，其間填充有成熟纖維組織，成骨細(xì)胞數(shù)較多，并見成熟哈弗斯管結(jié)構(gòu)，骨的重塑較為活躍，并有多個(gè)軟骨化中心出現(xiàn)。因此推斷在牽張間隙內(nèi)注射PRP對(duì)家兔脛骨牽張區(qū)的成骨質(zhì)量有顯著的加速作用。我們對(duì)家兔脛骨牽拉成骨區(qū)的新生骨質(zhì)作了骨密度測(cè)定，并測(cè)定牽張成骨區(qū)新生骨的生物力學(xué)強(qiáng)度。測(cè)試結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于空白對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了富血小板血漿對(duì)牽張區(qū)成骨質(zhì)量有明顯的促進(jìn)作用，而實(shí)驗(yàn)組中B組的測(cè)定結(jié)果明顯優(yōu)于A組，我們推測(cè)在牽張結(jié)束后的固定早期應(yīng)用PRP可以顯著促進(jìn)牽張成骨新生骨礦化進(jìn)程。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組A組在牽張?jiān)缙趹?yīng)用PRP后，牽張區(qū)皮膚炎癥反應(yīng)征象較B、C組明顯，出現(xiàn)皮溫升高、局部略紅腫征象，因此我們推斷在牽張期注射富血小板血漿(PRP)后，加重了延長(zhǎng)區(qū)的局部炎癥。這期間的PRP可能參與了局部的炎癥反應(yīng)，未能參與到后期的牽張區(qū)新生骨礦化的過(guò)程。

PRP來(lái)自于自身的血液，排異性小，使用相對(duì)安全，并且制作過(guò)程簡(jiǎn)便。自1984年首次報(bào)道PRP中的生長(zhǎng)因子能促進(jìn)骨缺損修復(fù)后，人們便迅速掀起了PRP的相關(guān)研究[9]。目前大量研究已在使用 PRP結(jié)合組織工程手段，利用PRP在體內(nèi)具有促進(jìn)骨再生的作用，結(jié)合干細(xì)胞或生物材料來(lái)治療骨不連、軟組織損傷等，尤其是 PRP結(jié)合支架材料治療骨缺損時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的成骨量明顯優(yōu)于對(duì)照組，這表明生物材料提高了PRP的效能，使其能夠充分發(fā)揮作用[10-11]。而本實(shí)驗(yàn)中牽張成骨區(qū)所形成的初期骨痂，為PRP提供了這種內(nèi)環(huán)境，作為一種天然的生物支架結(jié)構(gòu)，使PRP充分發(fā)揮效能。PRP在促進(jìn)骨再生的過(guò)程中主要通過(guò)在骨缺損的局部微環(huán)境中釋放一些生長(zhǎng)因子，而這些生長(zhǎng)因子是骨生長(zhǎng)再生中所必需的。它們之間通過(guò)復(fù)雜的互相作用，精密的調(diào)節(jié)協(xié)同促進(jìn)骨再生[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在家兔脛骨骨缺損治療上與PRP聯(lián)合應(yīng)用，來(lái)探究在牽張成骨過(guò)程中應(yīng)用PRP對(duì)成骨的影響，我們的研究觀察到骨愈合的初期PRP對(duì)牽張成骨新生骨的再生起到了促進(jìn)作用，特別是在牽張結(jié)束后的骨礦化期應(yīng)用PRP顯著促進(jìn)了牽張成骨的新生骨礦化進(jìn)程。