先天性心臟病患兒術(shù)后發(fā)生急性腎損傷的危險因素及早期檢測血清microRNA-203的意義

熊田辛，查正彪，鄭智，郭倩男，陳亮，潘友民

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 心臟大血管外科， 湖北 武漢 430030）

先天性心臟?。ㄒ韵潞喎Q先心?。┰谖覈鴩a(chǎn)兒中的發(fā)病率較高，占8‰～10‰[1]。近些年隨著心外科手術(shù)的日臻成熟，先心病患兒手術(shù)成功率也隨之提高，但是術(shù)后并發(fā)癥仍然是影響患兒預(yù)后最主要的原因，尤其是術(shù)后急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）的發(fā)生率甚至高達(dá)20%以上；且一旦術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重的AKI，迄今為止臨床尚缺乏理想的針對性治療[2]。因此，術(shù)后AKI 發(fā)生前早預(yù)測、合理干預(yù)仍然是目前臨床改善先心病患兒手術(shù)預(yù)后、降低病死率的關(guān)鍵。MicroRNA（miRNA）屬于一類內(nèi)源性短鏈RNA，具有組織特異性、結(jié)構(gòu)保守性等特點(diǎn)，在AKI 發(fā)病中扮演著重要角色。

腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1, KIM-1）是目前研究較為成熟的用于診斷AKI的特異性指標(biāo)[3]，在受損的腎臟組織中高表達(dá)，但是無法對AKI 的發(fā)生發(fā)揮預(yù)警作用，而且易受年齡、性別及免疫狀態(tài)等多種外源性因素的影響。有學(xué)者通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KIM-1 和miR-203 具有一定的調(diào)控作用[4]。本研究對采用改良兒童腎臟疾病風(fēng)險分級（pediatric risk injury failure loss and end stage renal disease, pRIFLE）。分析接受先心病手術(shù)發(fā)生AKI 的患兒的臨床資料，以探討AKI 發(fā)生的危險因素，以及術(shù)后血清miR-235 對AKI的臨床預(yù)警價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2018年1月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院住院的178 例先心病患兒。其中，男性107 例，女性71 例；年齡2 個月～6 歲，平均（4.37±1.42）歲。所有患兒入院后接受先心病體外循環(huán)體外直視手術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①年齡≤6 歲；②術(shù)前根據(jù)心電圖、超聲心動圖、胸片、常規(guī)檢查及生物化學(xué)檢查確診為先心病，其中57 例患兒為單純房間隔缺損（atrial septal defect, ASD），53 例患兒為單純室間隔缺損（ventricular septal defect, VSD），39 例患兒為ASD 合并VSD，29 例患兒為動脈導(dǎo)管未閉（patent ductus arteriosus, PDA）；③術(shù)前腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①先天性腎功能不全；②住院后造影劑、藥物等可能致腎損傷；③心臟衰竭或呼吸衰竭；④48 h 內(nèi)死亡或資料不全；⑤急診手術(shù)。本研究所有過程遵從赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬或法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 方法

根據(jù)pRIFLE 推薦的AKI 診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]： 術(shù)后48 h內(nèi)肌酐清除率（creatinine clearance, CC）較術(shù)前降低25%，或尿量＜0.5 ml/（kg·h）≥8 h，將患兒分為AKI 組53 例和非AKI 組125 例。

1.3 主要儀器及試劑

1.3.1 主要儀器Primus 麻醉機(jī)（美國Drager 公司），Jostra HL20心肺機(jī)（德國Maquel公司），iE33超聲儀（荷蘭Philips 公司），肝素鈉真空采血管（美國BD 公司）。

1.3.2 主要試劑硫酸阿托品注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號： 20160833），丙泊酚（德國Fresenius kabi 公司，批號： 10GF3917），咪達(dá)唑侖（瑞士Roche公司，批號： B1297），雷尼芬太尼（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號： 6150314），維庫溴銨（浙江仙居制藥股份有限公司，批號： 150116），七氟醚（美國雅培制藥公司，批號： 7928），酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），Taqman? MicroRNA Reverse Transcription Kit 和Taqman? MicroRNA Assay Kit 試 劑盒（日本TaKaRa 公司）。

1.4 方法

1.4.1 手術(shù)方法所有入組患兒采用心臟外科統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的麻醉、手術(shù)、體外循環(huán)和術(shù)后監(jiān)護(hù)。術(shù)前30 min 肌內(nèi)注射硫酸阿托品注射液0.1 mg/kg，靜脈推注丙泊酚1 mg/kg，待患兒入睡后進(jìn)入手術(shù)室。進(jìn)入手術(shù)室后，開放外周靜脈，咪達(dá)唑侖0.1 mg/kg、雷尼芬太尼1.0 ～1.5μg/kg 及肌松藥維庫溴銨0.6 mg/kg 誘導(dǎo)后插管麻醉，咪達(dá)唑侖、雷尼芬太尼、維庫溴銨及七氟醚吸入維持麻醉，連接Primus 麻醉機(jī)行機(jī)械通氣。正中開胸，體外循環(huán)下修補(bǔ)心臟畸形，連接Jostra HL20 心肺機(jī)行體外循環(huán)。采用iE33 超聲儀確定心臟畸形糾正后開始復(fù)溫，有需要時超濾至血紅蛋白（Hb）＞10 g/dl，使用正性肌力藥物。血流動力學(xué)穩(wěn)定后中和肝素，關(guān)胸后送至兒童重癥監(jiān)護(hù)病房。

1.4.2 一般臨床資料收集檢測所有患兒手術(shù)前后腎功能水平、尿量，記錄年齡、性別、體重、臨床診斷、先天性心臟病手術(shù)風(fēng)險評估共識（the risk adjustment for congenital heart sugery-1, RACHS-1）評分等。記錄術(shù)中體外循環(huán)時間、阻斷升主動脈時間、是否多次阻斷升主動脈、心肌保護(hù)方式[間斷性灌注4 ∶1 含血高鉀停跳液（以下簡稱血灌）或全晶體液（Custodial液，以下簡稱晶灌）]、是否超濾、是否深低溫停循環(huán)或低流量灌注（低于目標(biāo)灌注流量的一半以上），以及圍手術(shù)期血制品用量（包括體外循環(huán)預(yù)沖及術(shù)中、術(shù)后）等。

1.4.3 血液標(biāo)本采集患兒麻醉誘導(dǎo)前和拔管后2、12、24 及48 h 時采集外周靜脈血3 ml 置于肝素鈉真空采血管（美國BD 公司）中，取上清、分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 檢測指標(biāo)取血液標(biāo)本檢測Hb、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、血糖及乳酸。ELISA 檢測血液KIM-1 水平，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 檢測血清miR-203提取總RNA，根據(jù)Taqman?MicroRNA Reverse Transcription Kit 和Taqman?MicroRNA Assay Kit 試劑盒說明書操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆?。按照三步法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以cDNA 為模板，以小分子U6 作為內(nèi)參，冰浴中配制20μl。PCR 反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性0 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40 個循環(huán)，60℃繼續(xù)循環(huán)5 min。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得的資料設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-203 正向引物： 5'-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3'；反向引物： 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，長度97 bp。PCR 結(jié)果判斷： 根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct 值。ΔCt=Ct 樣品-Ct 內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt-（Ct 隨機(jī)陰性對照樣品-Ct內(nèi)參），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析；計數(shù)資料以（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線確定目標(biāo)指標(biāo)的診斷價值，采用二分類變量Logistic 回歸模型分析先心病患兒術(shù)后發(fā)生AKI 的危險因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 先心病患兒術(shù)后AKI 發(fā)生情況

根據(jù)pRIFLE推薦的AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)，53 例（29.78%）患兒術(shù)后發(fā)生AKI，125 例（70.22%）患兒未發(fā)生AKI。其中，45 例（84.91%）患兒術(shù)后24 h 內(nèi)發(fā)生AKI，8 例（15.09%）患兒術(shù)后24 ～48 h 內(nèi)發(fā)生AKI。

2.2 兩組患兒術(shù)前和術(shù)中臨床資料比較

兩組患兒年齡、術(shù)前紫紺型先心病比例、體外循環(huán)時間、阻斷升主動脈時間、采用血灌進(jìn)行心肌保護(hù)的比例及深低溫停循環(huán)或低流量比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），AKI 組年齡和采用血灌進(jìn)行心肌保護(hù)的比例低于非AKI 組患兒，而術(shù)前紫紺型先心病、深低溫停循環(huán)或低流量高于非AKI 組，體外循環(huán)時間、阻斷升主動脈時間長于非AKI 組。見表1。

表1 兩組患兒術(shù)前和術(shù)中臨床資料比較

2.3 兩組術(shù)前和術(shù)后不同時間點(diǎn)的KIM-1、miR-203 水平比較

兩組術(shù)前，以及術(shù)后2、12、24 和48 h 的KIM-1、miR-203 水平比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果： ①不同時間點(diǎn)的KIM-1、miR-203 水平有差異（F=31.864 和39.168，均P=0.000）；②兩組 的KIM-1、miR-203水平有差異（F=49.443 和118.218，均P=0.000）；③兩組的KIM-1、miR-203水平變化趨勢有差異（F=11.153 和24.857，均P=0.00）。AKI 組患兒循環(huán)血中KIM-1 水平在術(shù)后24 h時達(dá)峰值，而miR-203 水平在12 h 時已達(dá)峰值。見表2、3。

表2 兩組術(shù)前和術(shù)后不同時間點(diǎn)的KIM-1 水平變化 （±s）

表2 兩組術(shù)前和術(shù)后不同時間點(diǎn)的KIM-1 水平變化 （±s）

組別 n 術(shù)前 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h非AKI 組 125 264.75±78.36 268.93±85.17 269.77±86.43 261.36±90.79 254.63±88.31 AKI 組 53 283.01±92.85 300.13±124.98 350.25±81.29 626.36±147.86 581.43±110.71

表3 兩組術(shù)前和術(shù)后不同時間點(diǎn)的miR-203 水平變化 （pg/ml，±s）

表3 兩組術(shù)前和術(shù)后不同時間點(diǎn)的miR-203 水平變化 （pg/ml，±s）

組別 n 術(shù)前 術(shù)后2 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h非AKI 組 125 1.27±0.36 1.28±0.42 1.23±0.48 1.20±0.35 1.25±0.41 AKI 組 53 1.34±0.53 1.82±0.38 2.34±0.39 2.15±0.52 1.97±0.43

2.4 術(shù)后2 h 血清miR-203 對先心病患兒發(fā)生AKI 的預(yù)測能力

ROC 曲線分析顯示，術(shù)后2 h 血清miR-203 截斷值為1.700，其曲線下的面積為0.851（95% CI： 0.775，0.928），敏感性為85.42%（95% CI： 0.825，0.874），特異性為54.17%（95% CI： 0.537，0.587）。見圖1。

2.5 AKI 發(fā)生的危險因素

以發(fā)生AKI 作為因變量（AKI 賦值為1，非AKI賦值為0），將上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量，包括年齡、體外循環(huán)時間、阻斷升主動脈時間、術(shù)后2 h 血清miR-203 和、KIM-1 表達(dá)水平取中位值；以是否為紫紺型先心病、是否采取血灌方式，分別進(jìn)行賦值作為自變量，采用二分類變量Logistic 回歸模型分析先心病患兒術(shù)后發(fā)生AKI 的危險因素。引入水準(zhǔn)為0.05，剔除水準(zhǔn)為0.10。結(jié)果顯示，年齡＜4 歲、紫紺型先心病、體外循環(huán)時間＞175.68 min、阻斷升主動脈時間＞101.45 min 及術(shù)后2 h 血清miR-203＞1.70 是發(fā)生AKI 的獨(dú)立危險因素（P＜0.05）；而血灌心肌保護(hù)是發(fā)生AKI 的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見表4。

圖1 先心病患兒術(shù)后2 h 血清miR-203 預(yù)測AKI 的ROC 曲線

表4 先心病患兒術(shù)后發(fā)生AKI 的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

AKI 是先心病患兒術(shù)后預(yù)后不良甚至死亡的最主要原因之一，發(fā)生率為12.5%～71.0%[6]。本研究中共納入178 例先心病患兒作為受試對象，接受體外循環(huán)術(shù)后48 h 內(nèi)有53 例患兒出現(xiàn)AKI 指征，AKI 的發(fā)生率為29.78%，這與國內(nèi)的流行病學(xué)資料基本一致。體外循環(huán)屬于非生理性循環(huán)狀態(tài)，在整個手術(shù)過程中，機(jī)體血流動力學(xué)改變、非搏動性灌注、腎灌注壓降低、心內(nèi)吸引、持續(xù)灌注、易造成紅細(xì)胞損傷和全身炎癥反應(yīng)等都可導(dǎo)致術(shù)后AKI 的發(fā)生[7]。TODA 等[8]發(fā)現(xiàn)，先心病患兒術(shù)后發(fā)生AKI 的臨床特點(diǎn)和危險因素與成人不同，年齡越小，先心病患兒術(shù)后發(fā)生AKI 的風(fēng)險越高，這可能是因?yàn)榛純耗挲g越小，機(jī)體免疫功能和腎功能尚未發(fā)育完全，腎小管上皮細(xì)胞等還在繼續(xù)分化成熟。剛出生的新生兒腎小球?yàn)V過率僅為成年人群的50%，1 歲后才能達(dá)90%，說明患兒年齡越小，基礎(chǔ)腎功能越差。所以納入的患兒年齡＜6 歲，研究這一高風(fēng)險年齡段患兒體外循環(huán)術(shù)后發(fā)生AKI 的風(fēng)險因素更具有臨床價值。

本研究中，年齡＜4 歲、紫紺型先心病、體外循環(huán)時間＞175.68 min、阻斷升主動脈時間＞101.45 min及術(shù)后2 h 血清miR-203＞1.70 是發(fā)生AKI 的獨(dú)立危險因素，而血灌心肌保護(hù)是發(fā)生AKI 的獨(dú)立保護(hù)因素。首先年齡越小，患兒腎功能尚不成熟，可能會影響藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程，提高腎臟對手術(shù)和麻醉制劑的敏感性[9]。除此以外，由于先心病患兒長期慢性缺氧和充血性心力衰竭，出現(xiàn)紫紺的患兒基礎(chǔ)腎功能相對較差；而在手術(shù)過程中，體外循環(huán)和阻斷升主動脈時間越長，先心病患兒術(shù)后出現(xiàn)AKI 的風(fēng)險更高。胡秀紅等[3]曾提出先心病患者體外循環(huán)術(shù)前Scr 水平升高是影響AKI 發(fā)生的獨(dú)立危險因素。但是本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組患兒術(shù)前Scr 水平有差異，相反兩組患兒術(shù)前Scr 水平基本一致，這可能和兒童與成人的腎功能差異有關(guān)。Scr 屬于內(nèi)生性肌酐，是肌肉中的磷酸肌酸通過不可逆的非酶脫水反應(yīng)轉(zhuǎn)化而成，通過腎臟排出[9-10]。如果內(nèi)生肌酐的量相等，Scr 越低則CC 越高，理論上基礎(chǔ)腎功能越好[11]。但是內(nèi)生肌酐量與肌肉含量和質(zhì)量密切相關(guān)，圍產(chǎn)兒機(jī)體肌肉含量逐漸升高，并不像成人一樣維持在較為恒定的范圍內(nèi)，因此不能單純依靠Scr 水平診斷嬰幼兒AKI 的發(fā)生。

在前期調(diào)研和預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-203是KIM-1 的上游靶基因。本研究也證實(shí)，術(shù)后2 h 血清miR-203 水平是影響先心病患兒發(fā)生AKI 的獨(dú)立危險因素。KIM-1 是一種敏感性較高的腎功能損傷指標(biāo)，但是易受年齡、性別、基礎(chǔ)疾病及蛋白攝入等多種因素的干擾，最佳診斷效能的時間窗出現(xiàn)在術(shù)后12 ～24 h[12]，具有一定的滯后性且敏感性較低，易造成漏診或誤診。除Scr 外，尿量也屬于早期診斷先心病患兒發(fā)生AKI 的重要指標(biāo)，但是嬰幼兒的尿液采集較為困難，不適宜作為先心病患兒早期診斷AKI 發(fā)生的指標(biāo)之一[13]。

miRNAs 是真核生物基因中一類非編碼的負(fù)性調(diào)控RNA，可以通過與靶基因3'-非編碼區(qū)結(jié)合抑制RNA 轉(zhuǎn)錄[14]，但是miRNAs 在兒科領(lǐng)域的研究尚處于空白階段。通過XIAO 等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，KIM-1 與miR-203 的表達(dá)量具有一定的調(diào)控關(guān)系。在腎損傷小鼠模型腎組織中，miR-203 水平降低，并且與基因高甲基化狀態(tài)有關(guān)。但是本研究發(fā)現(xiàn)，小兒心臟手術(shù)后短期內(nèi)血清miR-203 呈升高趨勢，且在AKI 確診前，血清miR-203 表達(dá)變化較Scr、尿量出現(xiàn)得更早，并且miR-203 水平升高是先心病患兒發(fā)生AKI 的獨(dú)立危險因素，提示可以在早期預(yù)測先心病患兒發(fā)生AKI的風(fēng)險。體外循環(huán)導(dǎo)致患兒AKI 的原因十分復(fù)雜，但是均與急性期炎癥反應(yīng)有關(guān)，包括補(bǔ)體活化、細(xì)胞因子釋放及樹突狀細(xì)胞活化等，例如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）具有直接細(xì)胞毒作用，同時降低腎小球血流量和濾過率，刺激炎癥細(xì)胞浸潤。白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）也是導(dǎo)致腎小管損傷的重要因素。而近期LI 等[15]和WANG 等[16]都發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-203 水平可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，同時促進(jìn)TNF-α 和IL-6 的表達(dá)。除此以外，miR-203 能夠加速腎小管上皮細(xì)胞凋亡，加重腎小管損傷。因此在本研究中，AKI 組患兒術(shù)后血清miR-203 水平迅速升高可能與急性期炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[17]。

綜上所述，年齡＜4 歲、紫紺型先心病、體外循環(huán)時間＞175.68 min、阻斷升主動脈時間＞101.45 min及術(shù)后2 h 血清miR-203＞1.70 是先心病患兒體外循環(huán)術(shù)后發(fā)生AKI 的獨(dú)立危險因素，而血灌心肌保護(hù)是發(fā)生AKI 的獨(dú)立保護(hù)因素。圍手術(shù)期應(yīng)重視對危險因素的干預(yù)，以降低先心病患兒體外循環(huán)術(shù)后發(fā)生AKI的風(fēng)險。除此以外，血清miR-203 有望成為先心病患兒發(fā)生AKI 的早期預(yù)警分子，但是仍需大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。