替米沙坦對野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓的影響及機制研究*

苗少一，郭迪，楊閃閃，王春林，趙文飛，李宏云，馮永海

（鄭州大學第五附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450052）

肺動脈高壓指肺動脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，其發(fā)病機制復雜，尚未完全明確，其中動脈型肺動脈高壓（pulmonary hypertension, PH）是最主要類型之一[1]。有研究表明，炎癥和免疫失衡在肺動脈高壓發(fā)病中具有重要作用[2-3]。替米沙坦是一種特異性血管緊張素Ⅱ受體（AT1型）拮抗劑，是目前臨床治療高血壓的常用藥物[4]。已有研究報道替米沙坦可以抑制野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠肺動脈周圍炎癥，發(fā)揮其肺血管保護作用[5]。過氧化體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）是重要的細胞分化轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪組織、血管平滑肌組織高度表達，具有調(diào)節(jié)脂肪代謝和炎癥、免疫及細胞分化的作用[6]。替米沙坦具有PPAR-γ激活作用，本研究通過復制野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型，探討替米沙坦激活PPAR-γ 對肺動脈高壓大鼠炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級大鼠[SCXK（豫）2017-0001]32 只，體重180 ～200 g，由鄭州大學動物實驗中心提供，在鄭州大學第五附屬醫(yī)院中心試驗室按標準飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

野百合堿、GW9662 購自美國MCE 公司，替米沙坦購自德國勃林格殷翰藥廠，大鼠IL-6、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1, MCP-1）和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定（enzzyme linked immunsorbent assay, ELISA）試劑盒購自武漢博士德公司，BL-420E 生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟科技公司。

1.3 動物分組及模型復制

將32 只大鼠隨機分為對照組、模型組、治療組及干預組，每組8 只。對照組皮下注射生理鹽水1 次；模型組皮下注射野百合堿60 mg/kg 1 次，生理鹽水灌胃3 周。模型組皮下注射野百合堿60 mg/kg 1 次，復制當日起即開始替米沙坦10 mg/（kg·d）灌胃3 周。干預組在治療組基礎上腹腔注射GW9662 5 mg/（kg·d）3 周。

1.4 血流動力學

干預3 周后使用BL-420E 生物機能實驗系統(tǒng)，通過右心導管檢查測定右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure, RVSP）和肺動脈平均壓（mean pulmonary arterial pressure, mPAP），分離心臟并計算右心室肥大指數(shù)（right ventricular hypertrophy index, RVHI）。

1.5 肺組織病理學

在左肺門處橫剖，4%多聚甲醛固定肺組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片5μm 厚，行蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡及肺動脈的病理學變化。

1.6 ELISA 檢測炎癥因子

收集各組大鼠肺組織100 mg，加1ml 生理鹽水制備肺組織勻漿，4℃、120 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，嚴格按照試劑盒操作步驟進行檢驗，酶標儀在450 nm 波長處檢測吸光度值，計算肺組織中TNF-α、IL-6 及MCP-1 蛋白水平。

1.7 Western blotting 檢測肺組織PPAR-γ 表達

取各組肺組織標本，按照試劑盒說明書提取標本總蛋白及核蛋白。Bradford 法測定蛋白含量。取等量蛋白進行SDS-PHAGE 電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入一抗（PPAR-γ），4℃孵育過夜，洗膜后室溫孵育1 h，洗膜后ECL 化學發(fā)光顯影，以β-actin為內(nèi)參，實驗重復3 次。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用Tukey 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 比較

各組大鼠mPAP、RVSP 及RVHI 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，模型組較對照組高（P＜0.05），治療組、干預組較模型組低（P＜0.05），干預組RVHI 高于治療組（P＜0.05）。治療組與干預組mPAP、RVSP 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠肺動脈HE 染色結(jié)果

對照組大鼠肺部結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡較完整，肺動脈管腔較大，血管平滑肌較均勻，管壁結(jié)構(gòu)清楚，管壁及其周圍較少炎癥細胞浸潤（圖1A）。模型組大鼠肺部結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺動脈有不同程度增生，平滑肌明顯增生肥厚，管腔狹窄，管壁及其周圍可見較多炎癥細胞浸潤（圖1B）。治療組肺動脈管壁輕度增厚，動脈周圍可見少量炎癥細胞浸潤（圖1C）；與之相比，干預組肺動脈周圍炎癥細胞浸潤明顯增多（圖1D）。

表1 各組大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 比較（n =8，±s）

表1 各組大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 比較（n =8，±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與治療組比較，P ＜0.05。

組別 mPAP/mmHg RVSP/mmHg RVHI對照組 12.36±3.40 41.56±5.71 0.24±0.02模型組 38.23±4.95① 68.27±4.86① 0.39±0.02①治療組 25.98±4.58①② 53.53±8.39①② 0.30±0.01①②干預組 27.50±5.45①② 54.48±8.64①② 0.35±0.02①②③F 值 41.552 19.271 103.478 P 值 0.000 0.000 0.000

圖1 各組肺動脈病理切片 （HE 染色×100）

2.3 各組大鼠肺組織PPAR-γ 相對表達量比較

對照組、模型組、治療組及干預組大鼠肺組織PPARγ相對表達量分別為（0.991±0.226）、（0.227±0.141）、（0.906±0.173）和（0.168±0.029），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=50.021，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)Tukey 法，模型組和干預組較對照組降低（P＜0.05），治療組較模型組升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織PPAR-γ 相對表達量比較

2.4 各組大鼠炎癥因子水平比較

各組大鼠MCP-1、IL-6 及TNF-α 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組、治療組、干預組較對照組升高（P＜0.05），治療組、干預組較模型組降低（P＜0.05），干預組較治療組升高（P＜0.05）。見表2和圖3。

表2 各組大鼠MCP-1、IL-6、TNF-α 水平比較 （n =8，pg/ml，±s）

表2 各組大鼠MCP-1、IL-6、TNF-α 水平比較 （n =8，pg/ml，±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與治療組比較，P ＜0.05。

分組 MCP-1 IL-6 TNF-α對照組 83.52±16.15 65.01±17.45 56.53±14.98模型組 612.43±73.56① 461.40±95.11① 435.86±62.04①治療組 175.28±35.49①② 115.87±25.67①② 201.62±37.82①②干預組 303.42±60.31①②③ 286.67±50.59①②③ 299.70±42.40①②③F 值 161.472 82.315 112.216 P 值 0.000 0.000 0.000

圖3 各組大鼠MCP-1、IL-6、TNF-α 水平比較 （±s）

3 討論

本研究中野百合堿注射3 周后，模型大鼠肺動脈平滑肌明顯增厚，管腔狹窄，管壁周圍單核細胞浸潤明顯，證實野百合堿肺動脈高壓大鼠模型復制成功。

有研究表明，炎癥反應在肺動脈高壓病理改變的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，炎癥細胞的浸潤、遷移和聚集影響肺組織基質(zhì)重構(gòu)、膠原沉積及血管平滑肌細胞的增生和遷移，最終導致肺動脈的重構(gòu)，進一步加重肺血管阻力[7]。有研究發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者的肺動脈叢狀病損血管周圍有T 細胞、B 細胞及巨噬細胞等炎癥細胞浸潤[8]。炎癥細胞可通過分泌多種細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-18、MCP-1 及TNF-α 等，參與炎癥反應和肺血管的重組過程[2]。

血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑已成為治療心血管疾病如高血壓和代謝紊亂的安全、有效的一線臨床藥物。有研究指出，替米沙坦可通過其血管緊張素Ⅱ受體1型拮抗作用抑制血管肥大、重構(gòu)、細胞增殖等[9]。此外，替米沙坦還具有抗炎和抗氧化的作用[10]。在GUO等[5]研究中替米沙坦顯著降低了野百合堿肺動脈高壓大鼠肺組織炎癥因子水平，并可減輕肺小動脈周圍炎癥，與本研究結(jié)果一致。然而其抗炎機制尚不完全清楚，本研究在治療組中加入PPAR-γ 特異性阻斷劑GW9662 后，發(fā)現(xiàn)替米沙坦抗炎作用受到抑制，提示替米沙坦可能通過抑制PPAR-γ 發(fā)揮其抗炎作用，通過抑制肺小動脈周圍炎癥反應，改善肺動脈重構(gòu)，降低肺動脈壓力。

PPARγ 是依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核內(nèi)激素受體超家族，其對胰島素敏感組織的糖、脂肪的調(diào)節(jié)作用已被研究證實[11-12]。近年來發(fā)現(xiàn)，其還在基因轉(zhuǎn)錄層面上調(diào)控多種炎癥介質(zhì)表達，從而具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[13]。RASHID 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，正常肺組織中PPAR-γ 受體表達較廣泛，而肺動脈高壓患者的肺血管中PPAR-γ基因及蛋白表達明顯減少。本研究中，野百合堿可以導致肺組織中PPAR-γ表達下調(diào)，而替米沙坦可以有效上調(diào)PPAR-γ 的表達。由此筆者推測，替米沙坦治療肺動脈高壓的機制可能與上調(diào)PPAR-γ 表達從而抑制肺動脈炎癥反應有關(guān)，但其機制中是否包括通過上調(diào)PPAR-γ 從而抑制MMP-9、血管緊張素Ⅱ受體1 型mRNA 等表達，繼而抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖，仍需要進一步研究。LI 等[15]研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ 激動劑可以降低野百合堿誘導的肺血管重構(gòu)，提示PPAR-γ 可能是一個潛在的肺動脈高壓治療靶點。

綜上所述，替米沙坦可有效降低野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓，減輕肺血管重構(gòu)，其作用機制可能與上調(diào)PPAR-γ 表達，從而抑制肺小動脈炎癥有關(guān)。高PPAR-γ 受體活性與血管緊張素Ⅱ受體1 型拮抗雙重作用的新型血管緊張素受體阻滯類藥物或?qū)⒊蔀檠芯繜狳c。