初始阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)男性骨骼肌mRNA表達(dá)譜的影響及其作用機(jī)制

（南通大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院公共體育教研室，江蘇 南通 226019）

阻力運(yùn)動(dòng)即抗阻力運(yùn)動(dòng)，是一種通過(guò)肌肉反復(fù)收縮對(duì)抗負(fù)荷或負(fù)重刺激所進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)模式。目前普遍認(rèn)為足夠時(shí)間與強(qiáng)度的慢性阻力運(yùn)動(dòng)可增加肌力并促進(jìn)骨骼肌肥大［1-2］。目前研究［3］表明，體內(nèi)外多種因素的共同調(diào)控影響肌組織的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致肌組織的損傷或重塑。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)及分析方法已廣泛用于人體健康與疾病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及相關(guān)機(jī)制的研究。在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)領(lǐng)域，已有研究［4-6］探討了長(zhǎng)期慢性或急性單次阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)肌肉組織形態(tài)學(xué)及代謝的影響。然而，初次阻力運(yùn)動(dòng)者進(jìn)行非常規(guī)阻力運(yùn)動(dòng)的早期，肌肉細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜如何變化及其相關(guān)機(jī)制和潛在功能尚不明確［2］。

本研究針對(duì)未進(jìn)行過(guò)阻力運(yùn)動(dòng)的不吸煙健康成年男性，利用高通量的基因組學(xué)分析方法分析基因數(shù)據(jù)集GSE45426，探討在初始進(jìn)行阻力運(yùn)動(dòng)的不同階段骨骼肌mRNA表達(dá)譜的改變及其涉及的生物功能與分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和分組

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的人類(lèi)基因表達(dá)匯編（gene expression omnibu，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載骨骼肌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE45426。研究納入的16例受試者均是未進(jìn)行過(guò)阻力訓(xùn)練的健康不吸煙成年男性，平均年齡（22±2）歲，體質(zhì)量指數(shù)（23.0±2.0）kg/m2。受試者隨機(jī)分成運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組，每組8例。運(yùn)動(dòng)過(guò)程及標(biāo)本檢測(cè)：受試者均采取仰臥位，膝關(guān)節(jié)屈曲90°，測(cè)定最大等長(zhǎng)強(qiáng)度。（1）運(yùn)動(dòng)組，進(jìn)行2個(gè)周期的向心性阻力運(yùn)動(dòng)，每個(gè)周期均在等速測(cè)力計(jì)上以坐姿進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，雙腿分別先后從膝關(guān)節(jié)屈曲90°～180°并且以180°/s的角速度進(jìn)行5回合30次最大等速膝關(guān)節(jié)伸展，每回合間隔休息 1 min。每周期運(yùn)動(dòng)后 24 h采集優(yōu)勢(shì)腿肌肉活檢組織，2個(gè)周期間隔 48 h，2次活檢采集部位相距2.5 cm。（2）對(duì)照組，不做運(yùn)動(dòng)，但在相同時(shí)間點(diǎn)和對(duì)稱(chēng)的部位采集肌肉活檢標(biāo)本。2組飲食完全相同，具體見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。

1.2 基因數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與功能分析

受試者骨骼肌活組織提取總RNA，應(yīng)用Human Genome U133 Plus 2.0 進(jìn)行基因表達(dá)微陣列分析，數(shù)據(jù)集的Series Matrix數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析（以方差最大的探針為基本單位）。應(yīng)用Heat Mapper軟件制作熱圖。

應(yīng)用GEO2R對(duì)運(yùn)動(dòng)組、對(duì)照組配對(duì)樣本（運(yùn)動(dòng)/對(duì)照基線(xiàn)時(shí)分別對(duì)比運(yùn)動(dòng)/對(duì)照1周期或運(yùn)動(dòng)/對(duì)照2周期時(shí)）分別進(jìn)行差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEG）分析［7］。log倍數(shù)變化（logFC）≥1.5且調(diào)整P＜0.05為DEG。應(yīng)用Volcano Plot 繪制火山圖。

應(yīng) 用Bioconductor/cluster Profiler（Ver.3.6.0）函數(shù)包對(duì)DEG涉及的生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）進(jìn)行基因本體分析（gene ontology，GO）［8］。P＜0.05且FDRq＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

應(yīng)用Gene Set Enrichment analysis 3.0版軟件，以運(yùn)動(dòng)基線(xiàn)對(duì)比運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期為表型，先后以MSigDB在線(xiàn)基因集數(shù)據(jù)庫(kù)的hallmark/ KEGG/ BP gene sets作為參考基因集，對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)置為1 000次。以P＜0.05且FDRq＜ 0.25為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因集進(jìn)行領(lǐng)頭亞群基因分析。使用GPL570的注釋文件對(duì)領(lǐng)頭亞群基因分析所選定的探針進(jìn)行注釋?zhuān)胓enecards網(wǎng)站（www.genecards.org）匯總各個(gè)相關(guān)基因功能等信息。

2 結(jié)果

2.1 2組DEG分析

本研究中運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期和1個(gè)周期分別與基線(xiàn)（入組時(shí)）配對(duì)，共納入54 675個(gè)基因進(jìn)行了配對(duì)樣本DEG分析。結(jié)果顯示，對(duì)照組各時(shí)期的骨骼肌基因表達(dá)譜無(wú)顯著差異。與基線(xiàn)時(shí)比較，運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)1個(gè)周期后基因表達(dá)無(wú)顯著差異；運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后有231個(gè)DEG，其中228個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖1。

2.2 運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后DEG的GO分析

結(jié)果顯示，與入組時(shí)比較，運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后表達(dá)上調(diào)的DEG主要參與了胞外間質(zhì)組織形成、炎癥反應(yīng)、膠原纖維組織形成、細(xì)胞黏附、膠原代謝、骨骼系統(tǒng)發(fā)育和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)通路等生物過(guò)程。表達(dá)上調(diào)的DEG主要存在于細(xì)胞外區(qū)域、間隙、間質(zhì)、外泌體和膠原蛋白三聚體、蛋白質(zhì)性細(xì)胞外間質(zhì)、基底膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、血小板α顆粒腔、血液微粒和細(xì)胞表面。表達(dá)上調(diào)的DEG調(diào)控的分子功能主要包括細(xì)胞外間質(zhì)組成成分調(diào)節(jié)、膠原結(jié)合、整合素結(jié)合、肝素結(jié)合等。表達(dá)下調(diào)的DEG在GO分析中無(wú)顯著陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)表1。

2.3 運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后GSEA與領(lǐng)頭亞群基因分析

圖1 與基線(xiàn)時(shí)比較，運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后骨骼肌中的DEG分析結(jié)果Fig.1 DEG in the skeletal muscle cells of the exercise subjects after two sessions of exercise compared to those detected at baseline

結(jié)果顯示，與入組時(shí)比較，運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后標(biāo)本中富集了炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素-6、干擾素-γ等炎癥相關(guān)通路，以及PI3K、KRAS等細(xì)胞增生通路和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管新生、凋亡、缺氧、P53等相關(guān)通路，見(jiàn)圖2。在炎癥相關(guān)通路的領(lǐng)頭亞群基因分析中發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素-6、γ干擾素3條通路中均出現(xiàn)CXCL9、CXCL11、CXCL10、IL4R和IRF1基因，其中IRF1在3條炎癥通路和補(bǔ)體基因集中均可表達(dá)，見(jiàn)圖3。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，從未進(jìn)行過(guò)阻力運(yùn)動(dòng)的健康不吸煙成年男性進(jìn)行2個(gè)周期阻力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，骨骼肌中的基因表達(dá)譜與入組時(shí)相比具有顯著差異。C-C基序趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、補(bǔ)體成分3（complement component 3，C3）等基因表達(dá)升高。與入組時(shí)比較，表達(dá)上調(diào)的DEG大多位于細(xì)胞外區(qū)域或組織中，通過(guò)組成或結(jié)合細(xì)胞外間質(zhì)成分，參與胞外間質(zhì)組織調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)等相關(guān)生物過(guò)程；運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期的骨骼肌中富集了炎癥、增生、轉(zhuǎn)化與凋亡等相關(guān)通路；而運(yùn)動(dòng)1個(gè)周期的骨骼肌中DEG不顯著。

表1 運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后骨骼肌中顯著上調(diào)的基因表達(dá)譜的GO分析Tab.1 Gene ontology analysis of the expression profiles of genes significantly upregulated in the skeletal muscle cells of the exercise subjects after two sessions of exercise

目前認(rèn)為骨骼肌可在阻力運(yùn)動(dòng)的刺激下發(fā)生結(jié)構(gòu)與代謝等方面的改變，而且僅有＜2%的基因表達(dá)改變同時(shí)出現(xiàn)在急性單次和長(zhǎng)期慢性阻力運(yùn)動(dòng)后的骨骼肌中［5］。本研究發(fā)現(xiàn)初次進(jìn)行阻力運(yùn)動(dòng)的24 h對(duì)骨骼肌的基因表達(dá)譜無(wú)顯著影響，而間隔48 h后的再次阻力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練即可顯著改變運(yùn)動(dòng)者骨骼肌的基因表達(dá)，導(dǎo)致大量基因表達(dá)上調(diào)。因而證明，骨骼肌的基因表達(dá)在阻力運(yùn)動(dòng)的早期即存在動(dòng)態(tài)演變。已有研究［9-10］從骨骼肌代謝與分子水平證明阻力運(yùn)動(dòng)后的骨骼肌損傷與修復(fù)是連續(xù)的過(guò)程，本研究從基因水平進(jìn)一步證實(shí)，阻力運(yùn)動(dòng)早期的骨骼肌除了富集炎癥反應(yīng)相關(guān)通路外，還富集缺氧、血管新生、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增生等信號(hào)通路。

本研究還發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)相關(guān)通路的關(guān)鍵基因包括CXCL10、CXCL9、CXCL11、IL4R和IRF1。CXCL9、CXCL10和CXCL11均屬于CXC細(xì)胞因子家族，均通過(guò)結(jié)合細(xì)胞因子受體CXCR3發(fā)揮趨化作用［11］。CXCL10又稱(chēng)為γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10，通過(guò)活化或記憶T細(xì)胞而發(fā)揮多重免疫功能［12-13］。人類(lèi)細(xì)胞學(xué)與小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷后CXCL10表達(dá)增加，但在骨骼肌再生的過(guò)程中不是必不可少的［14］。CXCL9是γ干擾素誘導(dǎo)的單核因子，為γ干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞趨化因子［15］。在肌損傷的CXCL10敲除小鼠中CXCL9和CXCL11表達(dá)增加［14］。IL4R為Ⅰ型細(xì)胞因子受體，通過(guò)與白細(xì)胞介素-4結(jié)合，在B細(xì)胞中促進(jìn)IgE產(chǎn)生，在T細(xì)胞中促進(jìn)2型輔助T細(xì)胞分化［16-17］。目前發(fā)現(xiàn)IL4R異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［18］。IRF1最初發(fā)現(xiàn)可以激活細(xì)胞因子γ干擾素的表達(dá)，后來(lái)證實(shí)可與干擾素刺激反應(yīng)原件結(jié)合激活多種靶基因的表達(dá)，在機(jī)體免疫反應(yīng)、凋亡調(diào)控、DNA損傷與腫瘤抑制等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［19-22］。本研究結(jié)果顯示IRF1是唯一在多條炎癥相關(guān)通路中均發(fā)揮重要作用的基因。因此，CXCL10、CXCL9、CXCL11、IL4R和IRF1可能是非常規(guī)阻力運(yùn)動(dòng)后骨骼肌發(fā)生炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致?lián)p傷或再修復(fù)的關(guān)鍵基因。

圖2 運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后骨骼肌中基因表達(dá)譜的GSEA結(jié)果Fig.2 The results of gene set enrichment analysis of the gene expression profile of skeletal muscle cells of the exercise subjects after two sessions of exercise

圖3 運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)2個(gè)周期后骨骼肌中炎癥相關(guān)通路的領(lǐng)頭亞群基因分析結(jié)果Fig.3 Results of the leading-edge gene analysis of the inflammation-related pathways in the skeletal muscles of the exercise subjects after two sessions of exercise

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法，基于在線(xiàn)數(shù)據(jù)GSE45426分析證實(shí)未進(jìn)行過(guò)阻力運(yùn)動(dòng)的健康成年男性進(jìn)行阻力運(yùn)動(dòng)的早期，骨骼肌在缺氧、凋亡、炎癥、血管新生與細(xì)胞增生等多重通路上同時(shí)發(fā)生基因表達(dá)譜的變化，而且這種變化多發(fā)生于骨骼肌細(xì)胞外區(qū)域或結(jié)構(gòu)中。本研究對(duì)于探究阻力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌損傷與肥大的調(diào)控機(jī)制以及進(jìn)一步尋找調(diào)控靶點(diǎn)與措施具有重要意義。