白芍總苷預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷大鼠血腦屏障保護(hù)作用的研究

劉倩菁 劉祖秋 田穎 代小蘭

腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類生命健康的三大疾病之一，具有較高的致殘率和致死率，其中缺血性腦損傷約占60%～80%[1]。腦組織供血不足所致活性氧自由基和炎癥細(xì)胞因子大量生成導(dǎo)致血腦屏障通透性異常升高，進(jìn)而引發(fā)血管源性腦水腫，是缺血性腦損傷致殘、致死的主要原因[2-4]。因此，保護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整對(duì)減輕缺血性腦損傷具有重要意義。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是中藥白芍的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等多種藥理學(xué)作用[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TGP通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)缺血性腦損傷大鼠中樞海馬起到保護(hù)作用[7-8]，但TGP對(duì)缺血性腦損傷后血腦屏障是否具有保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討TGP預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷大鼠血腦屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠180只，體重（240±20）g，購自寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（浙）2019-0005]。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周[光照：黑暗12 h∶12 h，溫度（25±1）℃，自由飲水進(jìn)食]后開展實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平（nimodipine，NMP）10 mg/（kg·d）預(yù)處理組和TGP 50、100、200 mg/（kg·d）預(yù)處理組，每組30只。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 TGP膠囊（寧波立華制藥有限公司，規(guī)格 0.3 g/粒，批號(hào)：201901005）；NMP 膠囊（浙江海力生制藥有限公司，規(guī)格：20 mg/粒，批號(hào)：20190318）；伊文思藍(lán)（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：W20190129）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和 TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190317、20190128、20190402、20181229、20190130）；兔抗鼠腦組織閉合蛋白（Occludin）、閉鎖連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2、MMP-9、β-actin單克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201905016、201903031、201904012、201903027、201905023）；MR-96A 型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；SZ-1型組織勻漿器（江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；RM2125型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；BH-2型倒置光學(xué)顯微鏡及攝像（日本Olympus公司）；Allegra 21R型低溫離心機(jī)（美國Beckman公司）。

1.3 預(yù)處理給藥 取TGP膠囊內(nèi)容物并精確稱量后，加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度為10、20、40 mg/ml的TGP溶液；取NMP膠囊內(nèi)容物精確稱量，加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度為2 mg/ml的NMP溶液。TGP 50、100、200 mg/（kg·d）預(yù)處理組于造模手術(shù)前7 d開始給予濃度為 10、20、40 mg/ml的 TGP 溶液（5 ml/kg）灌胃，NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組給予2 mg/ml的NMP溶液（5 ml/kg）灌胃，假手術(shù)組和模型組分別給予0.9%氯化鈉溶液（5 ml/kg），均 1次/d。

1.4 缺血性腦損傷大鼠模型的制備 參照李振宗等[9]的報(bào)道，采用阻斷大腦中動(dòng)脈的方法制備缺血性腦損傷大鼠模型：術(shù)前12 h禁食禁水，麻醉后仰位固定、沿頸部正中切口，鈍性剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈至頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處，然后動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈、結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈殘端切口、插栓線（直徑0.235 mm，頭部灼燒呈釘子帽狀）入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇阻力止，深度距分叉處約18 mm，固定線栓、松開動(dòng)脈夾后逐層縫合皮膚并消毒處理；假手術(shù)組除不切口和插入線栓外，其余同模型組。造模術(shù)后24 h行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 血腦屏障通透性檢測(cè) 采用伊文思藍(lán)滲透法。每組大鼠各隨機(jī)取10只，以4 ml/kg劑量尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液，1 h后麻醉、開胸暴露心臟、由左心室-右心耳通路快速灌注300 ml 0.9%氯化鈉溶液、斷頭取腦，稱量右半腦重量后研磨勻漿，加3倍量50%的甲酰胺溶液，恒溫60℃孵育24 h后3 000 r/min離心15 min，取上清液。酶標(biāo)儀測(cè)定610 nm波長處吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定伊文思藍(lán)含量，腦組織伊文思藍(lán)含量可反映血腦屏障通透性。

1.6 腦組織含水量檢測(cè) 采用干濕比重法。每組大鼠各隨機(jī)取10只，麻醉后迅速斷頭剝?nèi)∧X組織，切取右側(cè)大腦稱重為濕重（W1），恒溫110℃烘烤24 h至恒重后為干重（W2），腦組織含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

1.7 腦組織生化指標(biāo)檢測(cè) 取每組剩余的10只大鼠，麻醉后迅速斷頭剝?nèi)∧X組織、切取右側(cè)大腦，剪碎后加入9倍量4℃預(yù)冷的裂解液、研磨勻漿制備腦組織勻漿液。

1.7.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 腦組織勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。

1.7.2 炎癥細(xì)胞因子檢測(cè) 腦組織勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液，按照各ELISA試劑盒操作說明依照步驟處理，通過酶標(biāo)儀測(cè)定炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 含量。

1.7.3 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。腦組織勻漿液經(jīng)恒低溫4℃12 000 r/min離心15 min后取上清液，提取總蛋白并采用二奎磷甲酸法（BCA）測(cè)定總蛋白含量，然后通過凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、經(jīng)5%脫脂奶粉37℃封閉1 h后，滴加兔抗鼠 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9、βactin一抗后，4℃恒溫孵育12 h后PBS溶液洗膜，滴加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h后PBS洗膜，滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色；然后以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性檢測(cè)結(jié)果比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示缺血性腦損傷大鼠血腦屏障通透性明顯升高；經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），且TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量低于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組（P＜0.05），提示TGP預(yù)處理具有保護(hù)缺血性腦損傷大鼠血腦屏障通透性的作用，見表1。

表1 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織含水量升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組大鼠腦組織含水量低于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組（P＜0.05），提示TGP預(yù)處理具有抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織水腫的作用，見表2。

表2 各組大鼠腦組織含水量比較

2.3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD、CAT活性均降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織SOD、CAT活性的降低及MDA含量的升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組SOD活性較NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組升高且MDA含量較NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組降低（均P＜0.05），但兩組大鼠CAT活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）；經(jīng) TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織TNF-α、IL-1β含量的升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組大鼠腦組織TNF-α含量低于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組（P＜0.05），但兩組大鼠IL-1β含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表 4。

2.5 各組大鼠腦組織 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP－9蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)下調(diào)而MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；經(jīng)TGP 50、100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織Occludin蛋白表達(dá)的下調(diào)和MMP－9蛋白表達(dá)的上調(diào)，經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制ZO-1蛋白表達(dá)的下調(diào)和MMP－2蛋白表達(dá)的上調(diào)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)較NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組上調(diào)而MMP－2表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05），兩組大鼠MMP－9蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1-2和表5。

表4 各組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子含量比較

3 討論

血腦屏障能夠阻止某些有害物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織，對(duì)保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。缺血性腦損傷早期即可出現(xiàn)血腦屏障破壞而引發(fā)血管源性腦水腫，是導(dǎo)致腦損傷疾病進(jìn)展的關(guān)鍵性病理變化。因此，保護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整對(duì)改善缺血性腦損傷預(yù)后具有重要意義。

白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，是我國傳統(tǒng)中藥品種，醫(yī)學(xué)典籍《本經(jīng)》中記載白芍具有“除血痹、破堅(jiān)積、治寒熱疝瘕、益氣”之功效，《別錄》記載白芍具有“通順血脈、緩中、散惡血、逐賊血”之功效。TGP為中藥白芍的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TGP具有良好的抗氧化、抗炎等生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈制備缺血性腦損傷大鼠模型，并于造模前7 d開始1次/d灌胃給予TGP進(jìn)行預(yù)處理，并以臨床治療缺血性腦損傷一線用藥NMP為陽性對(duì)照藥物，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGP預(yù)處理能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量滲透量和含水量的升高，并且給予TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理效果優(yōu)于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組，提示TGP預(yù)處理具有保護(hù)缺血性腦損傷大鼠血腦屏障通透性并抑制腦組織水腫的作用。

圖1 各組大鼠腦組織閉合蛋白（Occludin）、閉鎖連接蛋白-1（ZO-1）蛋白表達(dá)的電泳圖[A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平（NMP）10 mg/（kg·d）預(yù)處理組；D：白芍總苷（TGP）50 mg/（kg·d）預(yù)處理組；E：TGP 100 mg/（kg·d）預(yù)處理組；F：TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組]

圖2 各組大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表達(dá)的電泳圖[A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平（NMP）10 mg/（kg·d）預(yù)處理組；D：白芍總苷（TGP）50 mg/（kg·d）預(yù)處理組；E：TGP 100 mg/（kg·d）預(yù)處理組；F：TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組]

表5 各組大鼠腦組織Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較

血腦屏障是內(nèi)皮細(xì)胞依靠緊密連接蛋白復(fù)合體（tight junction protein systerm，TJPs）連接構(gòu)成的三維網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu)[10]；TJPs主要由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等相互作用形成。其中跨膜蛋白Occludin和胞質(zhì)附著蛋白ZO-1是構(gòu)成TJPs的主要成分，兩者相互作用組成TJPs的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。此外，Occludin能夠封閉內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙，Occludin缺失將導(dǎo)致TJPs細(xì)胞突起減少和骨架破壞，所以O(shè)ccludin對(duì)維持血腦屏障結(jié)構(gòu)完整具有至關(guān)重要的作用。ZO-1對(duì)細(xì)胞極性、胞旁屏障、TJPs骨架形成等具有重要作用，ZO-1缺失將直接影響TJPs生成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間縫隙增大而使血腦屏障通透性升高[11]。MMP是連接蛋白降解酶系統(tǒng)的重要組成部分，其中MMP-2、MMP-9能夠消化降解Occludin蛋白并可消化降解內(nèi)皮細(xì)胞基底層，從而破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)[12]。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在血腦屏障損傷病理進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。腦組織供血、供氧不足將導(dǎo)致線粒體呼吸鏈?zhǔn)茏瓒纱罅康腞OS，以ROS為底物的抗氧化酶SOD、CAT過度消耗而不能支撐ROS正常清除，導(dǎo)致ROS代謝失衡而過剩，攻擊核酸、蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA[13]。此外，ROS還將攻擊細(xì)胞膜而破壞細(xì)胞骨架，降解Occludin、ZO-1蛋白而破壞TJPs基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，從而破壞血腦屏障完整性[14]。

缺血性腦損傷發(fā)生后將病理性刺激炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β大量釋放，兩者是觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的趨化因子，在血腦屏障病理過程中具有重要作用。周喜燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β能夠直接破壞TJPs結(jié)構(gòu)，并可通過激活NF-κB而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子上調(diào)表達(dá)，并與內(nèi)皮細(xì)胞黏附而增加血腦屏障通透性。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)生缺血性腦損傷后腦組織SOD、CAT活性降低而MDA含量升高，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β含量升高，與張思然等[16]的研究報(bào)道一致；發(fā)現(xiàn)Occludin蛋白表達(dá)下調(diào)且MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，與王少朋等[17]的研究報(bào)道一致。經(jīng)TGP預(yù)處理則能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠SOD、CAT活性降低和MDA含量升高，抑制TNF-α、IL-1β含量升高，抑制Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)下調(diào)和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)；提示TGP對(duì)缺血性腦損傷大鼠血腦屏障的保護(hù)作用可能與抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及抑制Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)下調(diào)和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。