基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的清肺達(dá)原顆粒治療新型冠狀病毒肺炎多組分協(xié)同作用機(jī)制研究

居晨浩 吳夏秋 郭清

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)健康管理研究所

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）傳染性強，潛伏期長，對全球人類的生命健康構(gòu)成極大的威脅。截至4月30日，全球累計確診病例3 190 743例，累計死亡病例227 368例[1]。按照目前的形勢來看，全球新冠病毒感染狀況依然得不到有效控制，并且新增確診人數(shù)依然還處于上升的趨勢，形勢極其嚴(yán)峻。中醫(yī)藥千百年來一直守護(hù)著國人的健康，是疾病治療方法的寶藏[2]。縱觀古今，在同疫病抗?fàn)幹?，中醫(yī)防治疫病的學(xué)術(shù)體系和臨證方法也在不斷完善。從2019年12月COVID-19疫情爆發(fā)以來，中醫(yī)藥第一時間介入治療，以其獨特的優(yōu)勢成為中國疫情防控的一大利器，起到了舉足輕重的作用，到目前為止全國應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合療法已治愈大量患者。

清肺達(dá)原顆粒（Qingfei Dayuan Granules，QFDYKL）原名“肺炎1號方”，是由達(dá)原飲合柴陷湯加減化裁而成，組方包括柴胡、黃芩、法半夏、黨參、全瓜蔞、檳榔、草果、厚樸、知母、芍藥、生甘草、陳皮、虎杖共13味中藥。此方由國醫(yī)大師梅國強與湖北省中醫(yī)院巴元明等專家共同擬定而成，2020年2月23日經(jīng)湖北省防控指揮部科技攻關(guān)組推薦，并由湖北省人民政府正式對外公布QFDYKL制劑成功獲批并備案[3]。研究表明，使用QFDYKL等中西醫(yī)結(jié)合治療方案在改善COVID-19患者癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)等方面有較好的效果[4]。根據(jù)目前國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局提出的觀點，COVID-19屬于“濕毒疫”范疇，“濕邪”是本病的關(guān)鍵病因[5-8]。中醫(yī)認(rèn)為，QFDYKL具有“化濕解毒、和解少陽”的功效，但其活性成分、藥物靶點及其確切的分子機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從機(jī)制層面上實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的新方法，能夠為中醫(yī)藥的創(chuàng)新發(fā)展提供新的方法學(xué)依據(jù)[9]?；诖耍狙芯坷镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析QFDYKL治療COVID-19的有效成分、藥物靶點和關(guān)鍵途徑。

1 材料和方法

1.1 QFDYKL化學(xué)成分的搜集 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[10]檢索QFDYKL的化學(xué)成分，并借助醫(yī)學(xué)文摘資料庫（Excerpt Medica Database，EMBASE）、Web of Science核心合集、 護(hù)理學(xué)數(shù)據(jù)庫（Cumulative Index of Nursing and Allied Health Literature，CINAHL）等英文數(shù)據(jù)庫和知網(wǎng)、萬方等中文數(shù)據(jù)庫收集TCMSP未收錄的中藥化學(xué)成分。

1.2 活性成分篩選與靶點的預(yù)測 以化合物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為活性化合物的篩選條件[11-12]，借助TCMSP數(shù)據(jù)庫的藥物成分篩選過濾功能，篩選出QFDYKL中具有良好OB和DL的化合物，即活性成分。確定活性成分之后，再利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點預(yù)測功能，收集QFDYKL中化學(xué)成分對應(yīng)的靶點蛋白。對于TCMSP未收錄的化學(xué)成分，選擇Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得其簡化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry system，SMILES），導(dǎo)入到結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測靶點數(shù)據(jù)庫Swiss TargetPrediction （http：//www.swisstargetprediction.ch）和藥效團(tuán)模型預(yù)測靶點數(shù)據(jù)庫Pharm Mapper （http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）預(yù)測靶點。 最后利用Uniprot（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫將通過以上方法得到的化學(xué)成分的相關(guān)靶點蛋白基因名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 GO分析是注釋基因和分析這些基因生物學(xué)過程的主要生物信息學(xué)工具。KEGG通路數(shù)據(jù)庫是通過大型分子數(shù)據(jù)集生成的基因組測序和其他高通量實驗技術(shù)的實用程序數(shù)據(jù)庫資源來了解細(xì)胞、生物的高級功能和生物生態(tài)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫。本研究運用Cytoscape 3.7.0軟件中的ClueGO+Cluepedia插件進(jìn)行分析，以P＜0.05為統(tǒng)計指標(biāo)。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將QFDYKL的靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，將研究物種選擇為人類，設(shè)置條件score＞0.9為具有統(tǒng)計學(xué)意義，將具有PPI關(guān)系的結(jié)果以制表符分隔值（tab separated values，TSV）格式導(dǎo)出，再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化，并采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龉ぞ呒右苑治觥?/p>

1.5 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析和功能模塊分析 運用Cytoscape 3.7.0軟件及其插件構(gòu)建 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。運用Cytoscape 3.7.0軟件對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點中心性進(jìn)行分析，將度值（Degree）作為篩選條件，Degree越高，則與該成分相關(guān)的靶點越多，從而可以得出QFDYKL的核心成分。然后使用Cytoscape 3.7.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)展示圖，并使用分子復(fù)合物檢測（molecular complex detection，MCODE）插件確定PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的功能模塊，最終得到子網(wǎng)絡(luò)的核心基因（hub gene）。篩選條件設(shè)置：MCODE scores＞5，Degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100 and k-score=2。

2 結(jié)果

2.1 QFDYKL活性成分及其作用靶點信息的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)獲得QFDYKL中活性成分242種，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為閾值篩選條件，得到活性成分共200種，其中柴胡17種、黃芩15種、黨參21種、檳榔8種、草果8種、厚樸2種、知母15種、虎杖10種、陳皮5種、甘草92種、芍藥5種、瓜蔞2種。部分中藥具有相同的活性成分，其中MOL003896為黨參和甘草共有化合物，MOL004492為知母和黨參共有化合物，MOL000073為草果和檳榔共有化合物，MOL000354為柴胡和甘草共有化合物，MOL000098為柴胡、草果、全瓜蔞、虎杖、甘草共有化合物，MOL000422為柴胡、知母、芍藥、甘草共有化合物，MOL000006為全瓜蔞、虎杖、黨參共有化合物，MOL000211為芍藥、甘草共有化合物，MOL004328、MOL000359為陳皮、甘草共有化合物，MOL000449為柴胡、知母、黨參共有化合物。刪去18種相同成分后，共獲得182種活性成分。見表1。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得其SMILES，導(dǎo)入到Swiss TargetPrediction和Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫獲得靶點。隨后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對這些目標(biāo)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，整合去重后共獲得454個相關(guān)的作用靶點基因。

2.2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 該網(wǎng)絡(luò)包括652個節(jié)點，198種活性成分，454個蛋白質(zhì)靶點和6 588條邊。見圖1。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中成分或靶點結(jié)合度值大于平均節(jié)點Degree（10.114）的有167個，其中排名前6的成分為芍藥新苷（lactiflorin）、甘草酸（glycyrrhizic acid）、芍藥二酮（palbinone）、異甘草素（isoliquiritigenin）、槲皮素（quercetin）和山奈酚（kaempferol）；排名前6的靶點為雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、前列腺素內(nèi)過氧化物合 酶2 （prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor γ，PPARG）、 糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3B）、周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2），表明這些成分和靶點在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用。

表1-1 TCMSP中的182種有效活性成分及其參數(shù)Tab.1-1 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-2 TCMSP中的182種有效活性成分及其參數(shù)Tab.1-2 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-3 TCMSP中的182種有效活性成分及其參數(shù)Tab.1-3 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-4 TCMSP中的182種有效活性成分及其參數(shù)Tab.1-4 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-5 TCMSP中的182種有效活性成分及其參數(shù)Tab.1-5 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

圖1 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 “Composition-target” network

圖2 藥物靶點GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of drug targets

2.3 相關(guān)藥物靶點的GO富集分析和KEGG通路分析GO富集分析中分子功能 （molecular function，MF）主要涉及絲裂原活化蛋白激酶、活性氧反應(yīng)等，細(xì)胞組成（cell composition，CC）主要涉及質(zhì)膜的組成成分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，生物過程（biological process，BP）主要涉及內(nèi)肽酶活性、單加氧酶活性等。見圖2。KEGG通路分析提示共36條通路，藥物靶點主要集中在絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR/ErbB）信號通路、腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin systems，RAS）信號通路、RAS相關(guān)蛋白1（RAS-related protein1，Rap1）信號通路、鈣信號通路、cGMP依賴蛋白激酶G （cGMP dependentprotein kinase G，cGMP-PKG）信號通路。見圖3。藥物通過網(wǎng)絡(luò)中的藥物靶點，在酶活性的調(diào)控、血管生成和發(fā)育、細(xì)胞增殖調(diào)控和T細(xì)胞免疫調(diào)控等過程中發(fā)揮治療COVID-19的作用。

圖3 藥物靶點的KEGG代謝通路分析Fig.3 Analysis of KEGG metabolic pathways of drug targets

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果 將藥物靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，將研究物種選擇為人類，將minimum required interaction score設(shè)置為大于0.9，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。將PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，再將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯珼egree越高，在QFDYKL治療過程中可能發(fā)揮的作用越重要，取Degree排名前20的靶點。見表2。主要靶點為磷酸肌醇-3-激酶催化亞基α肽（phosphoinositide-3-kinase subunit α，PIK3CA）、淀粉樣β蛋白前體（amyloid β precursor protein，APP）MAPK1、MAPK3、90kDa熱休克蛋白αA1（heat shock protein 90kDa αA1，HSP90AA1）、C-X-C趨化因子受體4型（C-X-C motif chemokine receptor type 4，CXCR4）等。

2.5 藥物靶點的功能模塊分析 使用Cytoscape繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的4個功能模塊及其hub基因。見圖5。篩選條件為MCODE scores＞5，Degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100 and k-score=2。在PPI網(wǎng)絡(luò)中得分較高的4個功能模塊中，功能模塊1得分21分，功能模塊2得分13.429分，功能模塊3得分10分，功能模塊4得分8分。得分最高的功能模塊1包含毒蕈堿型乙酰膽堿受體2（muscarinic acetylcholine receptor M2，CHRM2）、APP、前列腺素E受體3基因（prostaglandin E receptor 3，PTGER3）等基因，涉及認(rèn)知、突觸形成等方面。

3 討論

QFDYKL由達(dá)原飲合柴陷湯加減化裁而成。小柴胡湯出自東漢·張仲景《傷寒論》，具有和解少陽的功效。血弱氣盡腠理開，邪氣陷入少陽表里之半，少陽經(jīng)氣不利，郁而化熱，不可汗吐下，只能治以和解樞機(jī)、扶正祛邪之法。柴胡苦平為治少陽要藥，透其邪熱、疏泄氣機(jī)；黃芩清熱，柴胡配黃芩共奏升散外邪、清泄郁熱、調(diào)和表里的效果[13]；生姜、半夏降逆化飲；人參、甘草、大棗和胃氣，顧護(hù)脾胃，諸藥相合，邪氣得解，上焦得通，津液得下，胃氣因和?！秱撘怼ぞ砩稀ち?jīng)正義》：“邪入少陽表里之半，宜雜用表里寒熱攻補之品，為防御解利之法?！盵14]達(dá)原飲出自吳又可[15]《溫疫論·溫疫初起》，由檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草7味藥組成。檳榔善消磨，能除伏邪瘴氣，為疏利氣機(jī)之藥；厚樸可破戾氣之所結(jié)；草果辛溫氣烈，防伏邪蟠踞，可化太陰之濕；邪氣盤踞募原，半表半里之地，外不得出表，內(nèi)不能入里，極易化熱，熱傷津液，故加知母清熱滋陰；芍藥入血分，先安未受邪之地；黃芩清余熱；甘草調(diào)和諸藥。諸藥合力，直搗巢穴，可使邪氣潰敗而速離募原，故名達(dá)原飲。小柴胡湯去生姜、大棗兩味溫補之藥，而加瓜蔞清熱化痰，陳皮理氣燥濕，虎杖清熱化濕、止咳化痰，合達(dá)原飲而成QFDYKL?？v觀全方，集清郁熱、祛疫邪、扶正氣、化痰濕、和解少陽于一體，用于治療COVID-19少陽兼痰濕熱郁肺甚佳。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network

表2 Degree前20的靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵傩訲ab.2 Topological properties of the top 20 targets in Degree in the PPI network

圖5 PPI功能模塊分析Fig.5 PPI functional modules analysis

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，揭示了QFDYKL可能的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)QFDYKL治療COVID-19是多靶點、多通路協(xié)同作用的結(jié)果。藥物活性成分主要來源于柴胡、黃芩、知母、黨參、甘草等中藥。相同的化合物可以來源于不同種類的中藥，同一化合物也可以對應(yīng)多個靶點，同一靶點也可以對應(yīng)不同化合物，這充分體現(xiàn)了中藥多靶點、多成分的作用特點。QFDYKL中排名前6的活性成分，在治療COVID-19過程中發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗炎、止咳平喘、增強機(jī)體免疫力等作用。甘草酸（glycyrrhizic acid）可以與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2 （angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合，干擾新型冠狀病毒與宿主的結(jié)合，抑制病毒侵入人體[16]。有研究表明，槲皮素（quercetin）可降低α平滑肌肌動蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等的表達(dá)，能夠抑制大鼠肺泡細(xì)胞凋亡，并減輕其肺組織炎癥以及纖維化損傷[17]。還有研究表明，山奈酚可以通過下調(diào)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）增強信號通路的表達(dá)，減輕急性肺損傷小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激損傷[18]。QFDYKL藥物活性成分則主要通過作用于ESR1、AR、PTGS2、PPARG、GSK3B和CDK2等靶點治療COVID-19。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，涉及MF的通路包括Ras信號通路、Rap1信號通路等，與化痰鎮(zhèn)咳平喘相關(guān)的通路包括cGMP-PKG信號通路等，與炎癥免疫相關(guān)的通路有花生四烯酸代謝 （arachidonic acid metabolism）等，與鎮(zhèn)靜相關(guān)的通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction），與解熱鎮(zhèn)痛相關(guān)的通路有鈣信號通路、cAMP信號通路等，提示QFDYKL通過調(diào)節(jié)炎癥免疫、解熱鎮(zhèn)痛等相關(guān)通路，發(fā)揮治療COVID-19的作用。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示，QFDYKL治療過程中發(fā)揮重要作用的核心靶點為PIK3CA、APP、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1 和 CXCR4等，這些靶點與細(xì)胞生長分化、凋亡、炎癥反應(yīng)以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)相關(guān)。進(jìn)一步篩選后得到的4個得分最高的功能模塊，其基因在治療COVID-19的過程中相互作用。

中醫(yī)藥學(xué)以“整體觀念”與“辨證論治”把握生命、疾病與藥物的關(guān)系，包含著中華民族幾千年的健康養(yǎng)生理念及其實踐經(jīng)驗，是中華文明的瑰寶，凝聚著中華民族的博大智慧[19]。中藥及其方劑具有多成分、多途徑和多靶點協(xié)同作用等特點，在防治傳染病方面具有其自身的特色和優(yōu)勢。在大數(shù)據(jù)的環(huán)境下，生物信息學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也應(yīng)運而生。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是研究藥物的新模式，其整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體觀念、辨證論治的原則不謀而合，與中醫(yī)藥研究的有機(jī)結(jié)合是一個具有創(chuàng)新性的研究方向[4]。有關(guān)新型冠狀病毒的相關(guān)研究正在不斷增多，不可否認(rèn)，本研究具有一定的局限性，有必要再通過相關(guān)實驗研究對QFDYKL治療COVID-19的作用機(jī)制進(jìn)行驗證。