紫檀芪對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究

何鵬展， 馬靜靜， 劉穎慧， 鄧 歡， 董衛(wèi)國

武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.中心實驗室； 3.老年病科，湖北 武漢 430060

胃癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，也是全球癌癥患者死亡的第三大原因。2018年全球新發(fā)胃癌病例估計超過100萬例，居全球惡性腫瘤發(fā)病率第五位；死亡率僅次于肺癌和肝癌[1]。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但它仍是嚴(yán)重危害人民健康的重要因素[2]。目前，手術(shù)、放化療是胃癌的主要治療方法[3]。約70%的胃癌患者確診時已處于晚期，這明顯限制了手術(shù)和放化療的療效[4]。傳統(tǒng)的化療藥物，如順鉑和5-氟尿嘧啶，由于耐藥性和細(xì)胞毒性而臨床療效不佳。因此，有必要尋找低毒、高效的天然抗癌藥物。

紫檀芪是白藜蘆醇的天然二甲基化類似物，主要存在于藍(lán)莓和葡萄中。紫檀芪與白藜蘆醇具有相似的藥理作用，如抗癌、抗氧化、降血脂、降血糖及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病的有益作用[5]。且由于有兩個甲氧基，紫檀芪比白藜蘆醇生物利用度更高，半衰期更長[6]。以往研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪對多種腫瘤均有一定的治療作用，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等[7-9]，但對胃癌作用尚不十分明確。因此，本研究探討了紫檀芪對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人胃癌細(xì)胞株HGC-27、SGC-7901、MGC-803和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1(中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC)；紫檀芪(美國Selleck公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；青霉素、鏈霉素、CCK-8試劑盒、Hoechst 33258染色試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；基質(zhì)膠、Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；AIF、Bax、Bcl-2、CytC、Survivin、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、MMP-9、MMP-2兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：人胃癌細(xì)胞株(HGC-27、SGC-7901、MGC-803)和胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)在質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清、1%抗生素溶液(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 g/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。均選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。分為紫檀芪處理組和陰性對照組，陰性對照組加入同濃度的DMSO。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗：用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力。將細(xì)胞(5×103個/孔)接種在96孔培養(yǎng)板中，第2天更換上清液，在含有紫檀芪(0、20、40、60、80、120、160 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl，再孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。以質(zhì)量濃度為100 g/L的CCK-8 DMEM/F12為對照。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實驗：將胃癌細(xì)胞接種于含新鮮培養(yǎng)基的6孔板(1×105個/孔)，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度為80%～90%時，用200 μl吸管尖端直尺劃痕，用PBS沖洗細(xì)胞，去掉漂浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，立即拍攝照片(0 h)。隨后，細(xì)胞在添加質(zhì)量濃度為30 g/L胎牛血清和不同濃度的紫檀芪(0、20、40、80 μmol/L)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在24 h和48 h拍攝照片。

1.2.4 Transwell實驗：胰酶消化胃癌細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基重懸后將100 μl的細(xì)胞懸液(約1×104)接種于Transwell小室的上層，預(yù)先在小室上層鋪有基質(zhì)膠(按1∶6稀釋)。下層加入質(zhì)量濃度為250 g/L胎牛血清的600 μl培養(yǎng)基。次日，更換含有紫檀芪(0、20、40、80 μmol/L)的下層培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h后，將小室用4%多聚甲醛溶液固定15 min，用質(zhì)量濃度為10 g/L結(jié)晶紫染色。

1.2.5 Hoechst 33258熒光染色法：將指數(shù)生長的胃癌細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)24 h。用含有紫檀芪(0、20、40、80 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后固定細(xì)胞，用PBS沖洗3次，按照說明書用Hoechst 33258染色液染色。在熒光顯微鏡下觀察和捕捉細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，如染色質(zhì)凝集和核碎裂。

1.2.6 Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)：將細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h，并暴露于上述不同濃度紫檀芪中。收集貼壁細(xì)胞，用PBS洗滌2次，最后將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，5 μl Annexin V-PE和10 μl 7-AAD在黑暗中共染色15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.7 DCFH-DA熒光探針測定ROS：將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后用上述不同濃度的紫檀芪再培養(yǎng)24 h。胃癌細(xì)胞在含10 μmol/L DCFH-DA的1 ml培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)30 min，用PBS洗滌3次。然后用熒光顯微鏡觀測。

1.2.8 Western blotting實驗：經(jīng)上述紫檀芪處理后，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，含質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶TBST中室溫封閉1 h，TBST清洗3次。隨后一抗4 ℃下孵育過夜，TBST清洗3次后，在室溫黑暗中二抗孵育1 h，再用TBST洗滌3次，最后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描。

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪抑制胃癌細(xì)胞的增殖CCK-8實驗結(jié)果顯示，紫檀芪能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，且呈時間和劑量依賴性。而在正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中，紫檀芪對其增殖的抑制作用較弱(見圖1)。此外，可觀察到在3株胃癌細(xì)胞系中，HGC-27對紫檀芪最敏感，因此選HGC-27進(jìn)行以下的實驗。

2.2 紫檀芪抑制胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果表明，紫檀芪對胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲均有抑制作用，呈劑量依賴性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。同時，與腫瘤侵襲性相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9在紫檀芪作用下明顯減少(P<0.05)(見圖3)。

圖1 紫檀芪對胃癌細(xì)胞和GES-1細(xì)胞增殖的影響 A：不同濃度的紫檀芪處理胃癌細(xì)胞(HGC-27、SGC-7901、MGC-803)24 h；B：不同濃度的紫檀芪處理HGC-27細(xì)胞12、24和48 h；C：不同濃度的紫檀芪對GES-1細(xì)胞的影響

圖2 紫檀芪抑制胃癌細(xì)胞遷移能力Fig 2 Inhibition of migration of gastric cancer cells by Pterostilbene

注：與對照組相比，#P<0.05。

2.3 紫檀芪誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡與對照組相比，不同濃度紫檀芪處理胃癌細(xì)胞后，胃癌細(xì)胞凋亡水平明顯增加，且隨濃度升高而升高。流式結(jié)果顯示，0、20、40、80 μmol/L的紫檀芪干預(yù)24 h后，胃癌細(xì)胞的凋亡率分別為(6.13±0.16)%、(13.97±2.03)%、(38.27±2.40)%和(64.30±2.92)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

2.4 紫檀芪誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生DCFH-DA測定胞內(nèi)ROS，結(jié)果表明，隨著紫檀芪濃度增加，綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，即胞內(nèi)ROS水平升高。這提示紫檀芪可能通過增加ROS、激活線粒體途徑，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡(見圖5)。

2.5 紫檀芪通過線粒體途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡為了進(jìn)一步研究紫檀芪誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，Western blotting檢測線粒體途徑相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，0、20、40、80 μmol/L的紫檀芪干預(yù)24 h后，隨著紫檀芪濃度增加，Bax、AIF、CytC、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達(dá)量也逐漸增加，Bcl-2、Survivin表達(dá)量逐漸減少(見圖6)。

注：與對照組相比，#P<0.05。 圖4 紫檀芪對胃癌細(xì)胞凋亡的影響 A：Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞(放大100倍)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率Fig 4 Effect of Pterostilbene on apoptosis of gastric cancer cells A: Hoechst 33258 staining for apoptotic cells; B: flow cytometry for apoptosis rate

圖5 紫檀芪對胃癌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(放大200倍)Fig 5 Effect of Pterostilbene on ROS in gastric cancer cells

3 討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，尤其是在一些亞洲國家。在中國，2015年胃癌死亡率在癌癥相關(guān)死亡中排第二位[2]。如今胃癌的篩查和監(jiān)測計劃及現(xiàn)有的治療方法遠(yuǎn)不能令人滿意[10]。臨床過程中會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、藥物不良反應(yīng)、耐藥等情況，導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，尋找高效安全的天然抗癌藥物刻不容緩。

細(xì)胞凋亡是抗癌藥物發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制，主要分為三條途徑：死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[11-13]。線粒體途徑又稱內(nèi)源性途徑，是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞死亡形式，對多細(xì)胞生物體的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。線粒體凋亡途徑的一個中心事件為線粒體通透性改變，通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)來實

注：與對照組相比，#P<0.05。 圖6 紫檀芪對胃癌細(xì)胞線粒體途徑的影響Fig 6 Effect of Pterostilbene on the mitochondrial pathway in gastric cancer cells

現(xiàn)[14]。線粒體是ROS的主要來源，也是ROS損傷的目標(biāo)。短暫的、可逆的MPTP開放與ROS的釋放有關(guān)，通過及時從線粒體釋放潛在的毒性ROS，幫助機(jī)體適應(yīng)氧化還原應(yīng)激。但在較高的ROS水平下，長時間和持續(xù)的MPTP開放可能發(fā)生ROS爆發(fā)性釋放，導(dǎo)致線粒體損傷[15]。隨著線粒體膜的受損，CytC和AIF從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase-9、caspase-3和caspase-7，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

紫檀芪作為白藜蘆醇結(jié)構(gòu)類似物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性。截至目前，已在體內(nèi)外多種癌癥細(xì)胞中表現(xiàn)出抗癌能力。據(jù)報道，線粒體途徑參與紫檀芪對肝細(xì)胞癌凋亡的誘導(dǎo)作用[16]。然而，目前其對胃癌的作用仍不十分清楚。本研究探討了紫檀芪對胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

用不同濃度的紫檀芪處理胃癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)紫檀芪對胃癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且呈時間和劑量依賴性，而對胃黏膜上皮細(xì)胞增殖抑制作用較弱。這提示紫檀芪的抗胃癌作用具有高效、低毒的特征。腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移主要是通過細(xì)胞的遷移和侵襲實現(xiàn)，細(xì)胞劃痕和Transwell實驗證明紫檀芪能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且抑制作用隨著濃度的增高而增強(qiáng)。同時，Western blotting實驗發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9表達(dá)也隨著紫檀芪濃度增高而減少，提示紫檀芪可能是通過降低MMP-2、MMP-9表達(dá)來發(fā)揮抗遷移和抗侵襲作用的。此外，Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均表明紫檀芪能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是MPTP的重要組成部分，分為抗凋亡(Bcl-2、Bcl-xl等)和促凋亡(Bax、Bcl-xs等)兩類。Bcl-2/Bax比值的降低能改變MPTP的通透性和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體斷裂和CytC的釋放[17-18]。此外，線粒體釋放AIF進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后移位到細(xì)胞核，介導(dǎo)染色質(zhì)凝聚，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。因此，我們進(jìn)一步檢測了線粒體途徑相關(guān)蛋白的水平，結(jié)果顯示，紫檀芪處理胃癌細(xì)胞后，Bax、AIF、CytC、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的水平顯著升高，Bcl-2和Survivin的水平顯著降低。

綜上所述，紫檀芪能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與增加細(xì)胞內(nèi)ROS激活線粒體途徑有關(guān)。本研究提示，紫檀芪在胃癌治療中具有潛在的應(yīng)用價值。