外源添加劑對黃貯小麥秸稈產(chǎn)甲烷潛力及微生物群落的影響

閆 晶，陸冰圓，席華悅，孟星堯，袁旭峰，朱萬斌，崔宗均

外源添加劑對黃貯小麥秸稈產(chǎn)甲烷潛力及微生物群落的影響

閆 晶1，陸冰圓1，席華悅1，孟星堯2，袁旭峰1，朱萬斌1，崔宗均1※

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，北京 100193； 2. 北京工商大學環(huán)境科學與工程學院，北京 100048）

為探討添加不同外源添加劑對黃貯小麥秸稈產(chǎn)甲烷潛力和微生物群落結構的影響，該研究以小麥秸稈為黃貯原料，添加乙酸（3‰ ACE組）和異型發(fā)酵乳酸菌復合系（3‰ MI1組，6‰ MI2組），調(diào)整含水率至50%，黃貯65 d后，以黃貯小麥秸稈為厭氧發(fā)酵原料，探究發(fā)酵過程中的指標性質(zhì)和微生物群落結構。研究發(fā)現(xiàn)黃貯預處理后，發(fā)酵系統(tǒng)中的初始揮發(fā)性有機酸中的乳酸和乙酸增加、甲烷含量增加、可溶性化學需氧量（sCOD）增加。添加了外源添加劑的ACE組、MI1組、MI2組的累積甲烷產(chǎn)量較干黃小麥秸稈（WS組）提高了4.7%～10.6%，而未添加添加劑的CK組的累積甲烷產(chǎn)量較WS組降低了9%。發(fā)酵系統(tǒng)中的主要優(yōu)勢細菌為和，優(yōu)勢古菌為甲烷鬃菌屬，黃貯預處理改變了發(fā)酵系統(tǒng)微生物的群落結構，促進了小麥秸稈的甲烷轉化，為木質(zhì)纖維素的沼氣轉化提供參考。

秸稈；添加劑；黃貯；產(chǎn)甲烷潛力；微生物群落

0 引 言

中國農(nóng)作物秸稈資源豐富，每年產(chǎn)生各類秸稈約10億t，因其富含有機質(zhì)，具有很好的產(chǎn)沼氣潛力，秸稈沼氣工程受到了越來越多的關注[1-2]，是目前秸稈資源化利用的有效途徑。但秸稈中復雜、堅固的木質(zhì)纖維素結構和高碳氮比的特性，使得秸稈沼氣工程存在發(fā)酵啟動緩慢、發(fā)酵周期長、秸稈降解不充分、沼氣產(chǎn)量低、品質(zhì)差等問題[3-5]，另一方面作物秸稈的季節(jié)性、時效性和易腐性不僅限制了沼氣工程全年連續(xù)運行和原料持續(xù)供給的可行性。因此，秸稈長期保質(zhì)貯存成為秸稈沼氣工程所面臨的重要問題。

目前常用的秸稈貯存方式有青貯、黃貯。青貯是把新鮮作物秸稈（含水率60%～75%）密封保存，秸稈上附著的乳酸菌在厭氧條件下利用可溶性碳水化合物生成乳酸等物質(zhì)，降低秸稈pH值，抑制其他微生物的活動，從而保存秸稈營養(yǎng)成分、減少物質(zhì)損失，實現(xiàn)新鮮秸稈的長期貯存，但此方法具有季節(jié)性[6]。黃貯與青貯原理一樣，不同的是以風干黃化的干秸稈為原料，可全年制作，但由于干秸稈纖維化、木質(zhì)化程度高，組成結構復雜堅韌，可溶性碳水化合物含量低，自然附著的乳酸菌少，因此需要在制作過程中添加適宜水分和少量添加劑[7]。黃貯添加劑有3種類型，一類是發(fā)酵促進劑，通過促進乳酸發(fā)酵來改善黃貯進程，如乳酸菌、纖維素酶、葡萄糖、蔗糖等[8-12]；一類是發(fā)酵抑制劑，通過降低原料pH值，直接形成適宜乳酸菌生活的環(huán)境來改善黃貯進程，如甲酸、乙酸、甲醛等[13-14]；還有一類是營養(yǎng)劑，提高原料營養(yǎng)價值，如糖蜜、尿素、磷酸二銨等[15-17]。崔憲等[18]研究了協(xié)同添加葡萄糖與同型乳酸菌、異型乳酸菌、乙酸對干黃玉米秸稈品質(zhì)和甲烷產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)添加添加劑后的黃貯玉米秸稈，干物質(zhì)損失少，產(chǎn)甲烷潛力高，黃貯過程更加穩(wěn)定。

目前關于青貯、黃貯秸稈的研究大部分集中于畜禽飼草的跨季節(jié)貯存，將其應用于沼氣工程原料貯存方面的研究較少。因此本文以自然風干黃化的小麥秸稈為原料，通過添加乙酸、異型發(fā)酵乳酸菌復合系來調(diào)控黃貯發(fā)酵過程，分析不同外源添加劑對黃貯小麥秸稈產(chǎn)甲烷潛力和微生物群落結構的影響，為秸稈沼氣工程原料高效貯存提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥秸稈為江蘇省徐州市沛縣干黃小麥秸稈，其基本性質(zhì)為：總固體93.3%、揮發(fā)性固體75.8%、總碳47.2%、總氮0.75%（均為質(zhì)量分數(shù)，下同）。

乳酸菌復合系為中國農(nóng)業(yè)大學生物質(zhì)工程研究中心構建的SLP-1異型發(fā)酵乳酸菌復合系，其組成菌主要為副布氏乳桿菌，植物乳桿菌，短乳桿菌，還有少量的副干酪乳桿菌，戊糖乳桿菌，粘膜乳桿菌。將SLP-1乳酸菌復合系活化后，30 ℃培養(yǎng)48 h，該樣品作為接種菌劑。

接種污泥取自中國農(nóng)業(yè)大學生物質(zhì)工程研究中心實驗室運行良好的水稻秸稈與牛糞共發(fā)酵的連續(xù)發(fā)酵罐。接種污泥基本性質(zhì)為：pH值7.4、總固體12.0%、揮發(fā)性固體4.5%、總碳18.2%、總氮1.66%。

1.2 試驗設計

1.2.1 小麥秸稈黃貯試驗設計

干黃小麥秸稈切成2～5 cm，噴灑自來水，調(diào)節(jié)水分至50%。CK組不添加添加劑，作為黃貯對照組，ACE組添加3‰乙酸，MI1組添加3‰乳酸菌復合系，MI2組添加6‰乳酸菌復合系，混合均勻后逐層裝入1 L藍蓋瓶中，壓實密封貯存65 d。

1.2.2 批次厭氧發(fā)酵試驗設計

黃貯秸稈（CK組、ACE組、MI1組、MI2組）和干黃秸稈（WS組）作為原料進行批次厭氧發(fā)酵試驗，采用500 mL藍蓋瓶作為反應器，發(fā)酵體積為300 mL。原料總固體1%（3 g），接種污泥總固體4%（12 g），體積不足300 mL時用自來水補足，以只加接種污泥和水作為發(fā)酵空白，每個處理3次重復。裝瓶后，通3～5 min氮氣，橡膠塞封口后置于（36±2）℃的恒溫培養(yǎng)室內(nèi)進行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵周期20 d。發(fā)酵過程中測定日產(chǎn)氣量和甲烷含量，并于發(fā)酵的0、2、4、6、8、10、15、20 d測定反應體系的pH值、揮發(fā)性脂肪酸、可溶性化學需氧量等指標，取厭氧發(fā)酵20 d樣品測定微生物群落結構。

1.3 測定指標

1.3.1 理化性質(zhì)測定

總固體（Total Solid，TS）采用烘干法，105℃烘干至恒質(zhì)量；揮發(fā)性固體含量（Volatile Solid，VS）采用馬弗爐550 ℃灼燒4 h；pH值測定采用便攜式筆式pH計（上海三信，SX610）；總碳（Total Carbon，TC）采用重鉻酸鉀-硫酸氧化法；總氮（Total Nitrogen，TN）采用凱氏定氮法；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素采用范氏（Van Soest）洗滌法[19]。

1.3.2 沼氣及其成分測定

日產(chǎn)沼氣量測定采用壓力法；甲烷含量采用氣相色譜儀（GC-2014, Shimadzu, Japan）；可溶性化學需氧量（soluble Chemical Oxygen Demand，sCOD）采用COD快速檢測儀（Lovibond E799718, 德國）消解，分光光度法測定；揮發(fā)性脂肪酸（Volatile Fatty Acids，VFA）采用島津LC-20A 高效液相色譜儀，色譜柱為BIO-RAD HPX-87H Lon Exclusion Column。

1.3.3 微生物高通量測序

對厭氧發(fā)酵20 d樣品進行細菌和古菌群落結構測定。高通量（Illumina Miseq）測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。使用E.Z.N.A.? soil試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.) 進行總DNA抽提，細菌使用通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R （GGACTACHVGGGTWTCTAAT）、古菌使用通用引物524F10ext（TGYCAGCCGCCGCGGTAA）和Arch958Rmod（YCCGGCGTTGAVTCCAATT）對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺對擴增子文庫進行測序。并在上海美吉生物云平臺對微生物進行菌群結構分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析使用 Microsoft Excel 2010、SPSS 20、Origin 9.1和Canoco for Windows 4.5。方差分析使用 Duncan的多范圍檢驗，其顯著性<0.05。

2 結果與討論

2.1 外源添加劑對黃貯小麥秸稈性質(zhì)的影響

表1為黃貯小麥秸稈的基本性質(zhì)，所有處理的pH值都較低，在4.2～4.7之間，酸香味醇厚，說明黃貯發(fā)酵良好。

表1 外源添加劑對黃貯小麥秸稈性質(zhì)的影響

注：所有數(shù)值均表示為平均值±標準偏差（=3），同一行不同字母表示差異顯著（<0.05）。

Note: All values were expressed as means ± standard deviation (=3); Different letters showed significant difference (<0.5).

不同黃貯處理后秸稈的粗纖維素含量不同，其中ACE組的半纖維素、纖維素含量最高，分別為27.3%、35.5%，CK組則顯著低于其他處理，分別為22.2%、31.8%，MI1組、MI2組間的則無顯著性差異?？梢婞S貯添加劑的添加有利于纖維素等可利用成分的保存。這是因為ACE組加入乙酸后，原料pH值迅速降低，直接形成適合乳酸菌但抑制其他微生物生長的環(huán)境，減少了黃貯過程中對木質(zhì)纖維素的降解[20-21]。MI1組、MI2組添加乳酸菌復合系后，體系中乳酸菌迅速生長繁殖，加快了其形成優(yōu)勢菌屬的時間，并產(chǎn)生大量乳酸、乙酸（乙醇）和CO2，使pH值下降，從而抑制體系中其他微生物的活動，亦減少了半纖維素和纖維素的降解[22]。CK組在黃貯過程中先是附著在原料上的酵母菌、腐敗菌、霉菌和醋酸菌等好氣性微生物利用原料的可溶性糖類生長繁殖，形成厭氧環(huán)境后原料上的腸細菌、梭菌、霉菌、酵母菌和乳酸菌等專性和兼性厭氧菌開始生長繁殖[23-24]，這一過程中，部分分解菌會將原料的木質(zhì)纖維素降解為可溶性糖類和有機酸來提供體系內(nèi)微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)，隨著黃貯過程的推進，體系內(nèi)pH值下降，從而抑制了其他微生物的活動。體系中的有機酸亦能破壞秸稈的木質(zhì)纖維素結構，對秸稈起到了一定的前處理作用[25]。

2.2 外源添加劑對黃貯小麥秸稈產(chǎn)甲烷的影響

2.2.1 外源添加劑對黃貯小麥秸稈厭氧發(fā)酵甲烷含量的影響

將黃貯小麥秸稈（CK組、ACE組、MI1組、MI2組）和干黃秸稈（WS組）作為厭氧發(fā)酵的原料，在含固率1%條件下進行批次厭氧發(fā)酵試驗。圖1為批次厭氧發(fā)酵中甲烷含量的箱形圖，箱形圖是一種統(tǒng)計數(shù)據(jù)分散情況的方法，能夠直觀顯示小麥秸稈在厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣過程中甲烷含量的數(shù)據(jù)分布以及不同處理之間的差異，從而確定有利于甲烷生產(chǎn)的處理[26]。從圖中可以看出，黃貯組的上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)、平均值均高于WS組，說明黃貯組的甲烷含量整體水平高于WS組，即黃貯預處理提高了甲烷發(fā)酵中的甲烷含量。結合發(fā)酵數(shù)據(jù)可知，最小值為發(fā)酵第1 d的甲烷含量，WS組的初始甲烷質(zhì)量分數(shù)最低，為9%，而黃貯組的初始甲烷質(zhì)量分數(shù)在11%～12%，可見黃貯預處理亦能提高小麥秸稈厭氧發(fā)酵的起始甲烷含量。其原因是黃貯預處理能夠為產(chǎn)甲烷菌提供更充足的營養(yǎng)物質(zhì)，增強產(chǎn)甲烷菌的活性和代謝強度，增加甲烷含量。

圖1 厭氧發(fā)酵過程中的甲烷含量

2.2.2 外源添加劑對黃貯小麥秸稈日產(chǎn)甲烷量和累積產(chǎn)甲烷量的影響

圖2為批次厭氧發(fā)酵中的日產(chǎn)甲烷量及累積產(chǎn)甲烷量，從圖中可以看出，WS組在整個發(fā)酵過程中僅在第4 d出現(xiàn)了1個產(chǎn)甲烷高峰，為15.3 mL/g (以TS計)。而黃貯組的小麥秸稈均出現(xiàn)了2個產(chǎn)甲烷高峰，其中CK組出現(xiàn)在第3、8 d，分別為16.56、14.40 mL/g；ACE組和MI1組均出現(xiàn)在第4、8 d，分別為19.45、17.2和18.34、16.68 mL/g；MI2組則是在第4、9 d出現(xiàn)2個產(chǎn)甲烷高峰，分別為17.15和16.24 mL/g?？梢婞S貯組不僅增加了發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷高峰出現(xiàn)的次數(shù)也提高了小麥秸稈的最大日產(chǎn)甲烷量，較WS組分別提高了8.2%、27.1%、19.9%、12.1%。CK組、ACE組、MI1組、MI2組、WS組的累積產(chǎn)甲烷量分別為175.8、213.7、202.2、207.9、193.2 mL/g，其中CK組的累積產(chǎn)甲烷量在前4 d高于WS組，之后一直低于WS組，最終比WS組降低了9.0%，其原因是黃貯過程中微生物生長代謝形成的小分子物質(zhì)，如乳酸，乙酸，甲醇，乙醇，H+，CO2等，在發(fā)酵前期提高了小麥秸稈的產(chǎn)甲烷量或產(chǎn)甲烷速率，之后小分子物質(zhì)被消耗后，再加上秸稈中可被厭氧發(fā)酵微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)，如半纖維素、纖維素，在黃貯過程中已被利用一部分，使得之后發(fā)酵過程的產(chǎn)甲烷量或產(chǎn)甲烷速率低于WS組。ACE組、MI1組、MI2組的累積產(chǎn)甲烷量始終高于WS組，最終比WS組提高了10.6%、4.7%、7.6%，比CK組提高了21.5%、15.0%、18.3%。黃貯組的小麥秸稈均在第13 d時甲烷產(chǎn)量達到累積甲烷產(chǎn)量的80%，而WS組是在第14 d時達到的，可見黃貯預處理能夠縮短甲烷產(chǎn)量達到累積產(chǎn)甲烷量的80%所用的時間，提高小麥秸稈的產(chǎn)甲烷效率。

圖2 日產(chǎn)甲烷量及累積產(chǎn)甲烷量

2.3 外源添加劑對黃貯小麥秸稈發(fā)酵環(huán)境的影響

2.3.1發(fā)酵過程中pH值的變化

發(fā)酵過程中pH值能影響體系中微生物活性而改變厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷效率[27]。厭氧發(fā)酵最適pH值在6.8～7.4之間，體系中可溶性有機物和木質(zhì)纖維素等被水解酸化，轉化為VFA并逐漸積累，pH值迅速下降，之后VFA被產(chǎn)甲烷菌利用生成甲烷，pH值開始上升。本試驗所有處理pH值變化差異不大（圖3），初始pH值在7.3～7.4之間，第4天左右下降至6.6，之后緩慢上升，發(fā)酵結束時所有處理pH值均穩(wěn)定在7.0。

圖3 厭氧發(fā)酵過程中的pH值變化

2.3.2 發(fā)酵過程中VFA的變化

VFA是厭氧發(fā)酵過程重要的中間產(chǎn)物，是影響厭氧發(fā)酵過程穩(wěn)定性的關鍵指標。圖4為發(fā)酵過程中VFA的變化，從圖中可以看出所有處理均只在發(fā)酵前8 d檢測到了VFA，可能是因為此后體系中有機物水解酸化轉化為VFA的速率與產(chǎn)甲烷菌將VFA轉化為甲烷的速率相一致的原因。此外本發(fā)酵體系中丙酸一直存在，這在純秸稈的厭氧發(fā)酵中是常見的，過多的丙酸會造成厭氧發(fā)酵酸敗，一般來說，丙酸質(zhì)量濃度達到1～2 g/L時會抑制體系中的產(chǎn)甲烷菌，本試驗中的丙酸含量較低未對發(fā)酵過程產(chǎn)生抑制作用[26,28]。在WS組中，初始VFA由乙酸和丙酸組成，濃度為0.51 g/L，在第4天是達到峰值0.63 g/L后降低。而黃貯組的初始VFA由乳酸、乙酸和丙酸組成，其初始值即為峰值，隨著發(fā)酵的進行，體系中的VFA含量逐漸減少。CK組乳酸的初始質(zhì)量濃度為1.1 g/L，高于ACE組的0.7 g/L，MI1組的0.6 g/L、MI2的0.4 g/L，乙酸的初始質(zhì)量濃度為0.16 g/L，低于ACE組的0.23 g/L，MI1組的0.38 g/L、MI2的0.42 g/L。這一結果說明了CK組在黃貯過程中以同型乳酸菌發(fā)酵為主，故其乳酸含量最高、乙酸最低，由于乳酸并不是有效的抗真菌劑，因此小麥秸稈中的可利用營養(yǎng)物質(zhì)可能會被酵母菌等所利用，物質(zhì)損失較大，累積產(chǎn)甲烷量反而降低。MI1組、MI2組黃貯過程中添加的是異型乳酸菌復合系，其發(fā)酵過程中除了生成乳酸外，還會生成乙酸（乙醇）和CO2，乙酸是有效的抗真菌劑，既能抑制微生物活性，減少物質(zhì)損失，又易被產(chǎn)甲烷菌利用，提高甲烷產(chǎn)量。

圖4 厭氧發(fā)酵過程中VFA變化

2.3.3 發(fā)酵過程中sCOD的變化

在厭氧發(fā)酵過程中，發(fā)酵液sCOD能夠反應發(fā)酵液中VFA、可溶性糖以及亞硝酸鹽、亞鐵鹽、硫化物等還原性物質(zhì)可被氧化的數(shù)量，從而掌握發(fā)酵進程[29]。發(fā)酵過程見圖5。

圖5 厭氧發(fā)酵過程中sCOD變化

在發(fā)酵初始時（圖5），WS組的sCOD最低，為0.94 g/L，而黃貯組在1.21～1.63 g/L，高于WS組，原因是黃貯過程中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸、乙醇等可溶性有機物，再加上其對木質(zhì)纖維素的分解，使得秸稈的sCOD 升高。在發(fā)酵過程中，所有處理均在第4、8天出現(xiàn)2個峰值，這與日產(chǎn)甲烷變化是相一致的。之后隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，sCOD降低。

2.4 外源添加劑對黃貯小麥秸稈厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結構變化規(guī)律的影響

2.4.1 外源添加劑對黃貯小麥秸稈微生物群落多樣性的影響

Alpha多樣性即為樣品物種多樣性，其中Chao、Ace指數(shù)反映微生物群落的豐富度，即群落中物種總數(shù)。Shannon、Simpson指數(shù)反映微生物群落多樣性，Shannon指數(shù)值越大群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)值越大群落多樣性越低。Coverage反映微生物群落的覆蓋度。從表2可以看出，發(fā)酵體系中細菌的物種多樣性指數(shù)均遠遠高于古菌，說明古菌微生物多樣性遠遠低于細菌。接種污泥細菌和古菌的Chao、Ace、Shannon指數(shù)均為最低、Simpson指數(shù)最高，說明小麥秸稈厭氧發(fā)酵后的微生物豐富度和多樣性均高于接種污泥。黃貯組的細菌豐富度和多樣性均高于WS組，即黃貯預處理能夠提高體系中的細菌多樣性，使體系更加穩(wěn)定。相反古菌中WS組Shannon指數(shù)最高、Simpson指數(shù)最低，說明其古菌多樣性高于黃貯組，但其甲烷含量和產(chǎn)量卻比較低?？梢婞S貯預處理有利于發(fā)酵體系中的細菌多樣性增加和古菌多樣性減少，故而有利于甲烷產(chǎn)量的提高。

注：相似性水平97%。

Note: Similarity level 97%.

2.4.2 外源添加劑對黃貯小麥秸稈厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中細菌和古菌群落結構的影響

圖6a為細菌的微生物群落結構，從圖中可以看出，在門水平上，不同處理發(fā)酵系統(tǒng)中細菌種類是相似的，只有相對豐度是不同的，其中主要菌群為擬桿菌門（）、厚壁菌門（）、變形菌門（）、綠彎菌門（）、互養(yǎng)菌門（）、、螺旋體門（）等。其中和為優(yōu)勢菌，占細菌總豐度的44.6%～69.6%，研究表明和是厭氧發(fā)酵水解酸化階段發(fā)揮主要作用的細菌群[30]，能夠將復雜的大分子有機物如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等水解酸化為小分子有機酸[26]。ACE組、MI1組、WS組細菌和古菌豐度之和較接種污泥分別提高了22.4%、5.5%、5.5%，而MI2組、CK組卻降低了21.6%、2.1%，結合產(chǎn)甲烷量發(fā)現(xiàn)，在本試驗中兩者豐度與甲烷產(chǎn)量并無直接關系。和這3類菌群多見于厭氧發(fā)酵體系中，對有機大分子物質(zhì)的水解起到一定的作用[31]。是一類能夠利用纖維素和半纖維素等碳水化合物的菌群[32]，厭氧發(fā)酵后各處理中的相對豐度較接種污泥提高了300～1 500倍，其中WS組中相對豐度最高，說明該處理中纖維素和半纖維素較多，水解酸化受到限制，這也是WS組產(chǎn)氣量不高的原因。

從古菌菌群結構中可以看出，本試驗厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的古菌在門水平上（圖6b）有2種優(yōu)勢菌門，廣古菌門（）約占56.6%～75.9%，泉古菌門（）約占23.7%～42.1%。目前已知的產(chǎn)甲烷菌主要屬于，能將厭氧發(fā)酵水解酸化過程中有機大分子物質(zhì)分解產(chǎn)生的H2和CO2、乙酸、甲基類等小分子物質(zhì)轉變成甲烷[33]。

在屬水平上（圖6c）主要有甲烷鬃菌屬（）、深古菌（）、甲烷桿菌屬（）、、甲烷馬賽球屬（）、甲烷八疊球菌屬（）等。是一類專營性嗜乙酸型古菌，其占優(yōu)勢說明本試驗中各處理均是以嗜乙酸產(chǎn)甲烷途徑為主要的產(chǎn)甲烷途徑。該菌屬在黃貯組的相對豐度為49.0%～70.1%，而WS組僅41.1%，是因為黃貯后的秸稈，特別是CK組，含有大量以乳酸和乙酸為主的有機酸，乳酸在發(fā)酵過程中亦可以轉化為乙酸，因此有利于其生長。為中一類具有多樣代謝方式的古菌屬，既能降解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸、芳香族化合物和甲基化合物等有機質(zhì)進行異養(yǎng)代謝，也能通過利用H2和CO2產(chǎn)乙酸途徑進行自養(yǎng)代謝，同時還能異化還原亞硝酸鹽和硫酸鹽、參與甲烷代謝循環(huán)，發(fā)生甲烷厭氧化作用等[34-36]。厭氧發(fā)酵后各處理中其相對豐度增加了0.37～1.43倍，推測該菌在纖維素分解中起到了積極作用。WS組中的相對豐度均高于黃貯組，分別為6.1%、5.0%、3.2%，是一種嗜氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，能將H2和CO2代謝生成CH4；是一類專營性嗜甲基型產(chǎn)甲烷菌，通過H2還原甲硫醇產(chǎn)甲烷[37-38]；是一類只有在H2存在的條件下，才能還原甲胺、甲醇生成CH4的甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[39-40]，說明WS組利用H2產(chǎn)甲烷途徑較黃貯組多?？梢婞S貯預處理影響了厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷古菌的分布，但由于決定古菌主導種類的因素是發(fā)酵底物類型，所以并未使主導型古菌發(fā)生變化。

2.4.3 微生物結構與發(fā)酵環(huán)境因子之間的相關性分析

圖7為微生物與發(fā)酵初始指標及累積產(chǎn)甲烷量之間的相關性分析。圖7a為細菌門水平上的相關性分析，從圖中可以看出，RDA1對細菌群落的影響占88.5%，其中WS組、MI1組、MI2組物種組成相近，而ACE組、MI2組分列兩側，物種差異較大，其中在ACE組豐度最高，且與sCOD和pH值成正相關，說明這些細菌有利于sCOD的轉化，同時適宜的pH值促進了纖維素分解速率，提高酸化水解速率[41]，這也是ACE組甲烷產(chǎn)量最高的原因。而MI2組中、、的相對豐度較高，與乙酸成正相關，說明這些細菌有利于乙酸的形成，其甲烷含量僅次于ACE組。整個發(fā)酵體系中影響水解酸化階段細菌群落結構變化的主要環(huán)境因子為sCOD和VFA，有利于后續(xù)產(chǎn)甲烷階段甲烷的生成。

圖7b為古菌屬水平上的相關關系，從圖中可以看出，甲烷產(chǎn)量與乙酸、丙酸呈正相關，與乳酸、VFA、sCOD呈負相關，這是因為在復雜的厭氧環(huán)境中，微生物能夠利用乙酸、丙酸等生成甲烷，但過高的乳酸則會抑制甲烷的產(chǎn)生，這與Zhao等人[24]的發(fā)現(xiàn)一致。甲烷產(chǎn)量與呈負相關，即其相對豐度越高對應的甲烷產(chǎn)量越低；與其他古菌屬呈正相關，即等古菌的相對豐度越高對應的甲烷產(chǎn)量越高。和是唯一可以利用乙酸產(chǎn)甲烷的產(chǎn)甲烷古菌，研究表明對乙酸的親和性更高，乙酸濃度較低時，甲烷鬃菌屬更易成為優(yōu)勢菌屬，而則在乙酸濃度較高時更易成為優(yōu)勢菌屬[42-44]，因此與乙酸呈正相關，與乙酸呈負相關。整個發(fā)酵體系中影響產(chǎn)甲烷階段古菌群落結構變化和甲烷產(chǎn)量的主要環(huán)境因子為乙酸，即乙酸濃度影響了菌群中的相對豐度，從而決定了甲烷產(chǎn)量。

圖7 細菌門水平、古菌屬水平與環(huán)境間的相關性分析

3 結 論

1）添加外源添加劑減少了黃貯過程中小麥秸稈的半纖維素、纖維素等營養(yǎng)成分的損失，有利于后續(xù)厭氧發(fā)酵過程甲烷的生成，其中CK組的累積產(chǎn)甲烷量為175.8 mL/g，較WS組的193. 2 mL/g降低了9%，而ACE組、MI2組、MI1組的黃貯小麥秸稈的累積產(chǎn)甲烷量分為213.7、207.9、202.2 mL/g，較WS組提高了4.7%～10.6%，較CK組提高了15.0%～21.5%。

2）在厭氧發(fā)酵過程中，黃貯組起始VFA濃度增加，主要為乳酸和乙酸的增加，隨著發(fā)酵的進行，丙酸成為VFA的主要組成酸；黃貯處理能提高沼氣中的甲烷含量，對小麥秸稈沼氣化利用有積極的作用。

3）厭氧發(fā)酵體系中優(yōu)勢細菌均為，優(yōu)勢古菌為，添加外源添加劑雖未改變厭氧發(fā)酵體系中細菌和古菌的優(yōu)勢菌群，卻改變了各自的群落結構，細菌多樣性增加，古菌多樣性減少，更有利于甲烷的生成。其中，對細菌群落結構影響最大的環(huán)境因子為VFA和sCOD；對古菌群落結構和甲烷產(chǎn)量的影響最大的環(huán)境因子為乙酸。

綜上，以干黃秸稈為沼氣工程原料時，添加乙酸、異型乳酸菌復合系的黃貯處理，不僅有利于秸稈的長期保存，還有效提高其產(chǎn)甲烷潛力。

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Effects of yellow silage additives on methane production and microbial community dynamics during anaerobic digestion of wheat straw

Yan Jing1, Lu Bingyuan1, Xi Huayue1, Meng Xingyao2, Yuan Xufeng1, Zhu Wanbin1, Cui Zongjun1※

(1.100193;2.100048,)

Straw-biogas-fertilizer has become one of the promoted utilization modes for the agricultural waste, particularly on large amount of crop straw that produced annually in China. However, a long-term storage of straw has posed a great problem on a straw biogas plant. A commonly used method, the yellow silage, can be expected to preserve nutrient, while reduce the dry matter loss of straw during storage. This study aims to explore the effects of yellow silage additives on methane production and microbial community dynamics during anaerobic digestion of wheat straw. The experiment was divided into two parts: yellow silage and anaerobic digestion. Yellow silage treatments were inoculated additives into the dry yellow wheat straw with a moisture content of 50% for 65 days, including CK group (without additives), ACE group (acetic acid addition of 3‰), MI1 group (lactic acid bacteria community addition of 3‰), MI2 group (lactic acid bacteria community addition of 6‰). The results showed that the pH of four groups below 4.7, indicating excellent fermentation quality. Hemicellulose and cellulose decreased during yellow silage, especially CK group only 22.2% and 31.8%, respectively. In the treatment with additives, the hemicellulose and cellulose content were significantly higher than that in the CK group, indicating that the addition of additives was helpful to preserve available nutrients. In the anaerobic digestion experiment, the raw materials were the yellow silage wheat straw (CK, ACE, MI1, MI2 group) and dry yellow wheat straw (WS group). The batch tests were conducted for up to 20 days at (36±2)℃. The working volume of each reactor was 300 mL, consisting of 12 g (TS) inoculum and 3 g (TS) substrate, with a TS content of 5 % and the remaining space filled with nitrogen gas. Inoculum without any added feedstock was used as a blank. Triplicate reactors were run for each treatment. The biogas production and methane composition were measured every day, whereas, the pH value, volatile fatty acids (VFA), soluble chemical oxygen demand (s COD) were measured during anaerobic digestion. High-throughput sequencing was used to determine the microbial community structure on the twentieth day of anaerobic digestion, in order to detect the effect of yellow silage pretreatment on the bacteria and archaea community in anaerobic fermentation system. The results from the anaerobic experiment showed that the VFA concentration and s COD increased significantly in yellow silage group at the initial stage, where mainly VFA in the fermentation system were lactic acid and acetic acid. As the fermentation time increased, the VFA concentration and s COD decreased after 2 days fermentation, where the propionic acid was the main component of VFA. The cumulative methane yield of ACE group, MI1 group, MI2 group were 213.7, 202.2, 207.9 mL/g, increased by 10.6%, 4.7% and 7.6%, respectively, compared with WS group (193. 2 mL/g), while CK group were 175.8 mL/g, decreased by 9.0% compared with WS group. After anaerobic digestion, the main bacteria were, while the main archaea wereindicating that the yellow silage can affect the microbial structure in the fermentation system. This finding can provide an important theoretical and technical support for energy conversion of crop straw in large-scale biogas production.

straw; additives; yellow silage; methane yield; microbial community

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2020-04-06

2020-08-10

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503137）

閆晶，博士生，主要從事農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用方面的研究。Email：849449907@qq.com

崔宗均，博士，教授，主要從事生物質(zhì)資源轉化與利用研究。Email：acuizj@cau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.15.031

S216.4; X712

A

1002-6819(2020)-15-0252-09