益氣養(yǎng)陰方對(duì)急性白血病細(xì)胞HL-60增殖和細(xì)胞形態(tài)的影響

孫靜，李笑，馬麗芳，張發(fā)艷

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

急性白血病是骨髓或造血組織中原始及幼稚血細(xì)胞大量異常急驟增生的惡性疾病，在血液系統(tǒng)疾病中危害性極高。我國(guó)的白血病死亡率為3.78/10萬(wàn)，是腫瘤死亡的十大死因之一[1]。急性白血病在35歲以下人群中死亡率居首位，成人急性髓系白血病化療緩解率約為50%～70%，3年無(wú)病存活率僅為20%～30%[2]。目前中醫(yī)藥治療腫瘤越來(lái)越受到重視，氣陰兩虛是多數(shù)實(shí)體瘤患者臨床常見的證型， 益氣養(yǎng)陰法可抑制腫瘤增殖, 改善體質(zhì)，降低西醫(yī)療法的毒副作用， 提高患者生存質(zhì)量[3]，但益氣養(yǎng)陰方對(duì)白血病作用機(jī)制不詳。本研究初步探討益氣養(yǎng)陰方含藥血清對(duì)體外白血病細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用白血病HL-60細(xì)胞株由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所腫瘤室饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠由濟(jì)寧市魯康動(dòng)物飼料經(jīng)銷中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK魯20130001)。

1.2 主要儀器與試劑

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；CO2培養(yǎng)箱(HERACELL240型，德國(guó)Heraeus公司)；倒置顯微鏡(TS100- F型，Nikon公司)；12孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(北京COSTAR公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)；MTT：CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 益氣養(yǎng)陰方及其水煎液制備

益氣養(yǎng)陰方組方：太子參30 g，黃精24 g，麥冬15 g，黃芪30 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，蒲公英30 g，小薊30 g，生地黃24 g，女貞子24 g，旱蓮草18 g，天冬15 g，白術(shù)12 g，茯苓12 g和甘草5 g。所用中藥飲片均購(gòu)置于山東建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥專家鑒定符合實(shí)驗(yàn)藥物標(biāo)準(zhǔn)。稱取上述中藥1劑劑量，加入8倍量蒸餾水浸泡1.5 h，快速加熱至沸騰，水沸后不斷攪拌并持續(xù)微沸狀態(tài)30 min，用紗布過(guò)濾，收集濾液，濾渣加1.5倍量水續(xù)煎20 min，趁熱過(guò)濾。合并兩次濾液，取濾液置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀中，濃縮至一定濃度，即得復(fù)方益氣養(yǎng)陰方水提取物，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 益氣養(yǎng)陰方含藥血清的制備

參照國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目《中藥復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究》關(guān)于“中藥含藥血清體外實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程”建議草案制備。將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，分別用生理鹽水和0.657 5 g/mL、1.315 g/mL、2.63 g/mL的益氣養(yǎng)陰方水煎液灌胃。每日早中晚各1次，每次4 mL，連續(xù)4 d灌胃，第5天早上灌藥2 h后，乙醚麻醉，于腹主動(dòng)脈取血。將血液置于無(wú)菌離心管中，在無(wú)菌狀態(tài)下，1 500 r/m離心10 min，分離出血清。取上清液，經(jīng)56 ℃、30 min滅活處理，用0.22 μm微孔濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌后，裝入無(wú)菌小瓶，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT比色法檢測(cè)HL-60細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，離心。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞終濃度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，并吹打成混懸液。并將此細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL。分別加入對(duì)照組、低劑量、中劑量、高劑量含藥血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL ，設(shè)置空白調(diào)零孔，加入等體積的PBS。在37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，分別作用24 h后，加入CCK溶液10 μL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在酶標(biāo)儀450 nm和570 nm處的波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(OD)，計(jì)算各組HL-60細(xì)胞增殖抑制率(IR)。

IR(%) =(1-含藥血清組OD值/等濃度的正常血清組OD值)×100%

2.4 Wright-Gimsa染色法檢測(cè)HL-60細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞懸液鋪入12孔板，細(xì)胞總數(shù)1×106個(gè)/孔，并設(shè)置高劑量組、中劑量組、低劑量組與對(duì)照組，分別加入各濃度含藥血清并使終體為2 mL/孔。作用48 h后，吸取各孔培養(yǎng)基至離心管，2 000 rpm離心5 min。棄上清，將底層沉淀細(xì)胞涂至預(yù)處理的載玻片上，將載玻片放入染色液中浸染5 min，然后用蒸餾水沖洗，室溫晾干。干燥后于倒置顯微鏡下觀察HL-60細(xì)胞形態(tài)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的含藥血清對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響

從圖1可以看出，低劑量組、中劑量組與高劑量組對(duì)HL-60細(xì)胞均具有一定程度的抑制作用。中劑量組、高劑量組的HL-60細(xì)胞抑制率均高于低劑量組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組的HL-60細(xì)胞抑制率高于中劑量組，組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，高劑量組的抑制增殖作用最強(qiáng)，細(xì)胞抑制率最高。

圖1 不同濃度的含藥血清對(duì)細(xì)胞OD值的影響

3.2 益氣養(yǎng)陰方對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組HL-60細(xì)胞經(jīng)含藥血清作用48 h之后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化。低劑量組HL-60細(xì)胞形態(tài)學(xué)略微發(fā)生變化，具體表現(xiàn)為極少數(shù)細(xì)胞核偏于一側(cè)，胞漿稍顯增多。中劑量組細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞的細(xì)胞核偏于一側(cè)，胞漿增多，細(xì)胞核略顯凹陷，細(xì)胞形態(tài)變化開始顯現(xiàn)。高劑量組發(fā)現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核偏于一側(cè)，胞漿增多，細(xì)胞核凹陷分葉明顯，細(xì)胞形態(tài)變化明顯，已經(jīng)到達(dá)中晚幼成熟階段。結(jié)果見圖2。

圖2 益氣養(yǎng)陰方對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響(Wright-Gimsa,×1 000)

3 討論

急性白血病是骨髓或造血組織中原始及幼稚血細(xì)胞大量異常急驟增生的惡性疾病，是我國(guó)腫瘤病人死亡的主要死因之一[1]。根據(jù)發(fā)病機(jī)制，治療白血病的重要策略是抑制這些異常的原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞的過(guò)度增殖和誘導(dǎo)其分化成熟。中醫(yī)學(xué)將急性白血病歸為“急勞”“虛勞”“血證”“熱勞”等范疇，認(rèn)為其發(fā)病機(jī)理常為正氣虛損與邪毒內(nèi)侵并舉，正邪相爭(zhēng)，久病則虛，毒在骨髓、氣血津液傳變，致使臟腑氣血功能受損失調(diào)，氣血虧耗，內(nèi)虛為本，病情反復(fù)[4]。因此本虛標(biāo)實(shí)是疾病的根本，氣陰兩虛是該病的特點(diǎn)，尤其在疾病經(jīng)過(guò)化療后和疾病進(jìn)展到后期時(shí)此特點(diǎn)更為明顯。因此治療應(yīng)該以益氣養(yǎng)陰為主[5-6]，輔助以清熱解毒、涼血止血。本實(shí)驗(yàn)所用益氣養(yǎng)陰組方體現(xiàn)了中醫(yī)以扶正為主，益氣養(yǎng)陰，兼顧祛邪的治療策略。方中太子參重用，以補(bǔ)氣生津，用黃精以滋陰益氣，麥冬以養(yǎng)陰生津，使精血化生有源而填精益髓，氣旺津生，共同針對(duì)氣陰兩虛的本虛病機(jī)，起到主要治療作用。黃芪助太子參健脾益氣而生血，補(bǔ)諸虛之不足。白花蛇舌草、蒲公英與半枝蓮合用，契合熱毒與瘀血互結(jié)的標(biāo)實(shí)病機(jī)，有清熱解毒、化瘀通絡(luò)的功效。佐以生地黃填骨髓、清血熱、養(yǎng)陰津。旱蓮草、女貞子歸肝腎經(jīng)，在補(bǔ)肝腎之陰的前提下，又輔以小薊行涼血止血之功，白術(shù)、茯苓既可健脾益氣，又可佐制大劑清熱涼血解毒藥的苦寒之性，顧護(hù)脾胃運(yùn)化功能，共奏輔助正氣，兼顧祛邪之療效。

既往臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，益氣養(yǎng)陰方對(duì)白血病患者和模型動(dòng)物具有較好的治療作用。有臨床研究表明[7]，利用益氣養(yǎng)陰方聯(lián)合西藥化療治療急性白血病患者，患者血紅蛋白、血小板升高而白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，同時(shí)骨髓造血得到改善，疾病總體緩解率為85.3%，顯著優(yōu)于單純西醫(yī)治療。另有研究者利用益氣養(yǎng)陰方灌胃于白血病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)癥因子子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α水平顯著下降，并且減輕白血病細(xì)胞組織浸潤(rùn)，有利于大鼠恢復(fù)[8]。董軍等[9]利用益氣養(yǎng)陰方觀察白血病小鼠的尾尖靜脈血細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰組有核細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少，有核細(xì)胞多為成熟的分葉核粒細(xì)胞，核呈分葉狀，粒細(xì)胞顆粒消失，染色質(zhì)細(xì)微，淋巴細(xì)胞呈淺灰藍(lán)色，無(wú)顆粒，胞漿明顯減少，核漿比例明顯升高。筆者研究結(jié)果從細(xì)胞水平上與上述研究結(jié)果相一致，初步證實(shí)益氣養(yǎng)陰方體外在抑制HL-60細(xì)胞增殖的同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，增加成熟細(xì)胞的比例，尤其是大劑量組，細(xì)胞形態(tài)變化最明顯，已經(jīng)使白血病細(xì)胞到達(dá)中晚幼成熟階段。研究還發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方可誘導(dǎo)急性白血病細(xì)胞HL-60衰老和使細(xì)胞阻滯在G2-M期[10]。

綜上，益氣養(yǎng)陰方具有抑制白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其分化的作用，其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，從而在臨床上更好的得以應(yīng)用。