桂參通脈膠囊對心衰大鼠心室重構(gòu)MMP-1及TIMP-1的表達(dá)研究

趙中秋，高琪，梁君昭，劉暢，徐洋，劉鑫，譚毅

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021)

慢性心力衰竭(CHF)是一種由多種因素引發(fā)的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的疾病，是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的終末期，臨床表現(xiàn)為患者心臟排血量不足、充盈能力低下、全身組織器官灌注不足等癥狀。眾多患者深受其擾，有研究證實(shí)，歐洲5億人口中患有CHF有200萬～1 000萬之多，且4年生存率僅為50%，在我國，以心力衰竭為因的死亡人數(shù)較過去40年增加了6倍。而美國大約有500萬患者，且每年新增的心衰患者超過55萬之多[1-2]。

近年來對該病的研究逐步深入，目前其治療方案多以利尿強(qiáng)心擴(kuò)管為主，需長期口服相關(guān)藥物，不僅治療費(fèi)用昂貴，而且現(xiàn)代藥物的毒副作用也不可忽視，如抗心律失常藥物最易引起心律失常，常用藥物阿托品，其藥理作用多，甚者易出現(xiàn)中樞不良反應(yīng)，某些治療心衰的藥物如PDEs、Ca2+通道阻滯劑等，實(shí)際上可能對心衰弊大于利。

中醫(yī)藥治療該病療效確切，毒副作用較小，特別是中醫(yī)藥針對心力衰竭發(fā)展的不同階段的辨證施治，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療該病的獨(dú)特優(yōu)勢。為此，筆者在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合西安市中醫(yī)醫(yī)院長期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，參照現(xiàn)代藥理研究成果，將桂枝、黨參、茯苓、葛根、郁金等藥物在嚴(yán)格的藥房制劑規(guī)范下制成具有補(bǔ)氣益心、活血通脈、化痰祛濁的桂參通脈膠囊。該制劑經(jīng)過臨床前期藥效實(shí)驗(yàn)表明，對胸痹之心氣虧虛、心悸乏力、心肌缺血、心律失常等心血管疾病效果確切。

慢性心力衰竭(CHF)主要的病理改變是心室重塑，究其原因，應(yīng)與交感神經(jīng)系統(tǒng)、RAAS系統(tǒng)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制酶(TIMPs)等的平衡失調(diào)與紊亂有關(guān)。因此，穩(wěn)定MMPs與TIMPs平衡，延緩心室重構(gòu)，減慢心衰進(jìn)度，是治療慢性心衰的路徑之一。在前期臨床研究的基礎(chǔ)上，筆者初步假設(shè),桂參通脈膠囊防治心衰的機(jī)理可能與調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌、改善血流動力學(xué)有關(guān)，從而抑制神經(jīng)體液機(jī)制，阻斷RAAS系統(tǒng)，阻止和延緩心室重構(gòu)，達(dá)到減少心衰復(fù)發(fā)、延緩病程、延長生存期的目的。因此，本研究主要通過應(yīng)用桂參通脈膠囊干預(yù)心衰大鼠模型，從MMP-1及TIMP-1的角度探討桂參通脈膠囊對心室重構(gòu)的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑

桂參通脈膠囊由西安市中醫(yī)醫(yī)院提供，規(guī)格：0.45 g×36粒；卡托普利，12.5 mg/粒(湖南漢森制藥股份有限公司，批號：H43021388)；0.9%氯化鈉注射液；肝素鈉注射液；注射用鹽酸阿霉素(鹽酸多柔比星)；MMP-1、TIMP-1抗體。

1.2 動物分組

選取雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g。按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)將其分為正常對照組、心衰模型組和桂參通脈低、中、高劑量組及卡托普利組，每組各10只。除正常對照組外，其余大鼠以腹腔注射鹽酸阿霉素(ADR)造模。

1.3 造模方法

注射用鹽酸阿霉素加入滅菌注射用水5 mL使之溶解，后加置0.9%生理鹽水中，配成每1 mL生理鹽水含鹽酸阿霉素0.8 mg的溶液。除正常對照組外，其余分別在第1、3、5周大鼠腹腔注射鹽酸阿霉素溶液3 mg/kg，在第2、4、6周腹腔注射鹽酸阿霉素溶液2 mg/kg，每周1次，共注射6次，每只大鼠累積用量為15 mg/kg。正常對照組同時腹腔注射等容積的生理鹽水。造模成功的指標(biāo)為：造模組大鼠表現(xiàn)萎靡不振，進(jìn)食、活動量減少，體質(zhì)量、體溫明顯下降，心功能測定其舒張期心臟左室內(nèi)壓變化最大速率及心率值均明顯低于正常組。

1.4 給藥方法

桂參通脈低、中、高劑量組分別給予0.034 g/(kg·d)、0.068 g/(kg·d)和0.135 g/(kg·d)桂參通脈膠囊，卡托普利組給予6.75 mg/(kg·d)卡托普利，空白對照組和心衰模型組給予同體積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥4周。

1.5 觀察指標(biāo)

于小鼠心臟左室前壁處取一定重量的心肌組織，采用蛋白免疫印記法(Western blot)測定MMP-1、TIMP-1的活性，用凝膠成像系統(tǒng)量化分析各組間MMP-1、TIMP-1吸光度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，MMP-1在心衰模型組的表達(dá)程度顯著升高，通過桂參通脈膠囊干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組可顯著降低MMP-1蛋白表達(dá)，且明顯低于卡托普利組(P>0.05);與心衰模型組相比，卡托普利組、桂參通脈中、高劑量組分別是其0.77倍、0.56倍、0.54倍。TIMP-1的蛋白在正常對照組表達(dá)最高，心衰組表達(dá)最低，通過桂參通脈膠囊干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，卡托普利組、桂參通脈中、高劑量組均明顯上調(diào)，其中以桂參通脈高劑量組上調(diào)明顯(P<0.05)。結(jié)果見表1和圖1～圖4。

表1 各組大鼠血清MMP-1和TIMP-1水平比較

圖1 Western blot法測定MMP-1表達(dá)

圖2 MMP-1顯色結(jié)果吸光度值

圖3 Western blot法測定各組TIMP-1表達(dá)結(jié)果

圖4 TIMP-1顯色結(jié)果吸光度值

3 討論

桂參通脈膠囊是由桂枝、黨參、黃芪、炒白術(shù)、葛根、川芎、郁金、茯苓、清半夏和延胡索等藥物組成的純中藥復(fù)方制劑[3]，具有補(bǔ)氣益心、活血通脈、化痰祛濁之功。其中桂枝、黨參為君藥，以助陽行氣、溫通經(jīng)脈；黃芪、茯苓、炒白術(shù)共為臣藥，以健脾、寧心、益氣；葛根、郁金、川芎、清半夏、延胡索為佐藥，其中前三者可升陽活血、清心解郁；延胡索可達(dá)活血散瘀、理氣止痛之功。從現(xiàn)代藥理來看，上述藥物均有擴(kuò)張血管、強(qiáng)心利尿等作用[4-7]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療心力衰竭的“黃金三角”一致。

在心力衰竭心室重塑演變過程中，心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠原網(wǎng)架、血管床的組成和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得心肌順應(yīng)性及收縮力下降，從而導(dǎo)致心功能不全[8]。其中引起左心室擴(kuò)大及心室重構(gòu)的關(guān)鍵因素是ECM成分的合成及代謝失衡，生理狀態(tài)下，ECM是連接心肌細(xì)胞的重要組成部分，起著信息傳遞、細(xì)胞支架及協(xié)調(diào)心肌舒張收縮功能的重要作用，對維護(hù)心臟結(jié)構(gòu)與功能完整性有重要意義。而膠原代謝過程因受眾多因素調(diào)控而更為復(fù)雜，基質(zhì)金屬蛋白酶( MMPs) 是一類含有鋅離子的內(nèi)源性蛋白水解酶，當(dāng)pH值合適時，其可將ECM 的大部分成分完全降解，內(nèi)源性抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs) 作為MMPs 的天然抑制劑。MMP/TIMP介導(dǎo)的膠原降解是心肌重塑和心功能不全的主要過程[9]。

MMP-1是 MMPs家族中的一員，參與細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)過程及心肌重構(gòu)，且發(fā)揮重要作用，其來源于心肌纖維細(xì)胞的分泌，正常人組織中MMP-1表達(dá)水平極低，但在病理性修復(fù)或重塑過程中，細(xì)胞因子等因素刺激情況下，體內(nèi)MMP-1水平明顯增加。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時，MMP-1 將被大量釋放到血清中，導(dǎo)致血清中MMP-1水平顯著上升[9]。TIMP是一種內(nèi)源性糖基化蛋白質(zhì)，作用是抑制MMPs的生物活性，可調(diào)控MMPs的生物活性與代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分裂與死亡；由成纖維細(xì)胞、其他結(jié)締組織細(xì)胞及較廣范圍的其他細(xì)胞所分泌，廣泛存在于組織和體液中與MMP-1有高度親和性，抑制其活性表達(dá)。因此，TIMP-1/MMP-1的平衡是活性中心以1∶1的比例結(jié)合，阻斷MMP-1與底物的結(jié)合，抑制其活性，從而減少M(fèi)MP-1對膠原基質(zhì)的降解。

在心衰發(fā)展過程中，由于心臟生理性代償機(jī)制，導(dǎo)致心肌間質(zhì)重塑，造成心臟結(jié)構(gòu)擴(kuò)大，心肌順應(yīng)性減低，收縮力不足，致使心輸出量減低，導(dǎo)致一系列并發(fā)癥發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白質(zhì)免疫印跡法，觀察CHF大鼠MMP-1、TIMP-1水平。與正常對照組相較，心衰模型組MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值明顯升高，TIMP-1水平明顯減低。TIMP-1對MMP-1的抑制作用減弱，細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白降解，致使重構(gòu)發(fā)生。與心衰模型組比較，各用藥組MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值下降，TIMP-1水平升高。針對MMP-1，下降最為顯著的是桂參通脈膠囊高劑量組，中劑量組次之。針對TIMP-1，上升最為顯著的是桂參通脈膠囊高劑量組，中劑量組和卡托普利組次之。桂參通脈膠囊高劑量組MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值下降，TIMP-1水平升高，優(yōu)于卡托普利組。

綜上，筆者認(rèn)為桂參通脈膠囊能降低CHF大鼠MMP-1水平，提高TIMP-1的表達(dá)，降低MMP-1/TIMP-1比值，延緩CHF發(fā)展，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。