基于差異蛋白組學(xué)探討復(fù)方鉤藤降壓片與替米沙坦對左心室肥厚干預(yù)的作用研究

周曼麗，簡維雄,2*，王健章,3，馮宇，錢舒樂,3，張家齊,3，俞赟豐

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

人體和各種生命物質(zhì)皆是由蛋白質(zhì)組成。迄今為止，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)有100多萬種, 可以按不同的組成、結(jié)構(gòu)和修飾組成各種細(xì)胞和生命物質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)從整體角度分析了細(xì)胞生命過程中，其內(nèi)部動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平、修飾狀況、蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)與其他生物分子之間的相互作用, 從而了解蛋白質(zhì)的功能及其在生命過程中的作用。由于疾病的發(fā)生和藥物治療靶點(diǎn)大多數(shù)是在蛋白質(zhì)(包括酶、受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白) 水平，因此，蛋白質(zhì)組學(xué)適用于研究藥物的作用機(jī)制、尋找有效的藥物靶點(diǎn)以及開發(fā)新藥。為此，本項(xiàng)目應(yīng)用同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)開展了復(fù)方鉤藤降壓片和替米沙坦對左心室肥厚干預(yù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動物

選用SPF級12周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)20只，隨機(jī)平均分為CGTA干預(yù)組和TMST干預(yù)組。體質(zhì)量(250±20)g，雄性。在人工調(diào)控的環(huán)境中22 ℃～26 ℃飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，連續(xù)干預(yù)12周后用于實(shí)驗(yàn)。飼料及墊料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(SHR大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼料購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司)。

1.2 試劑

Trypsin(Promega公司，美國)；三乙胺碳酸氫鹽儀、TEAB(Applied Biosystem公司，意大利)；乙腈、甲酸(Sigma公司，美國)；2-D Quant Kit(GE Healthcare公司，美國)；8標(biāo)iTRAQ 試劑(Applied Biosystem公司，意大利)；復(fù)方鉤藤降壓片(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科)；替米沙坦片劑(江蘇萬鄭生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 儀器

離心機(jī)(5430r)(Eppendorf公司，德國)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Advantage)(密理博，美國)；多功能生物樣品均質(zhì)器(precellys24)(Bertin，法國)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(VCX130)(Sonics，美國)；小型垂直電泳槽(Mini-PROTEAN Tetra Cell)(伯樂，美國)；掃描儀(powerlook2100xl)(UMAX,美國)；酶聯(lián)免疫吸附儀(iMark)(伯樂，美國)；SCX強(qiáng)陽離子交換液相色譜柱(菲羅門公司，美國)；Online HPLC(LC-20AD nanoHPLC)、Offline HPLC(C-20AB HPLC)(島津公司，日本)；質(zhì)譜儀(Q EXACTIVE)(賽默飛世，中國)。

2 方法

2.1 心肌組織蛋白質(zhì)提取

2.1.1 樣品前處理

稱量樣品，每個(gè)樣品稱取0.1 g進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 蛋白提取

參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行提取。1)將樣品置于研缽，在液氮條件下研磨成粉末；2)把粉末轉(zhuǎn)至加有裂解緩沖液Lysis Buffer離心管中，混勻，置于冰上5 min后加入終濃度為10 mmol/L的DTT，冰浴超聲5 min；3)25 000×g4 ℃離心20 min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入5倍以上體積冷丙酮沉淀過夜；4)25 000×g4 ℃再次離心20 min，棄上清；重復(fù)加入冷丙酮，搗碎沉淀，高速離心后棄上清；5)風(fēng)干沉淀中殘余丙酮，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟后留取上清；6)向蛋白液加入終濃度10 mmol/L的DTT， 56 ℃水浴1 h；7)加入終濃度55 mmol/L的IAM，暗室放置45 min后循環(huán)上述實(shí)驗(yàn)過程，最后25 000×g4 ℃離心15 min，取上清用于定量。

2.1.3 定量信息

2.1.3.1 蛋白質(zhì)濃度測量(Bradford定量法)

參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。1)準(zhǔn)備BSA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，向10管的標(biāo)準(zhǔn)品量(0.2 μg/uL BSA)添加純水，使最終體積為20 μL。管1是不含蛋白的參照，其他管分別含有0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 μg蛋白;2)將樣品稀釋一定倍數(shù)至測量范圍內(nèi)，每個(gè)樣品各取20 μL至管中;3)向每管添加180 μL protein assay reagent，混合，室溫培養(yǎng)10 min;4)用酶標(biāo)儀測量595 nm下的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

2.1.3.2 定量曲線

Bradford工作液(考馬斯亮藍(lán)G-250)和蛋白在酸性條件下結(jié)合時(shí)，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與在595 nm的吸光值成正線性相關(guān)關(guān)系[2]。R2=0.991 7,呈線性關(guān)系。定量曲線見圖1。

圖1 定量曲線

2.1.3.3 定量數(shù)據(jù)

兩組大鼠心肌組織定量數(shù)據(jù)見表1。

表1 兩組大鼠心肌組織定量數(shù)據(jù)比較

2.1.3.4 SDS電泳蛋白質(zhì)條帶信息

配置12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠。每個(gè)樣品分別與4×loading buffer混合，95 ℃加熱5 min。每個(gè)樣品上樣量為30 μg，Marker(97 KDa,66 KDa,43 KDa,31 KDa,20 KDa,14 KDa)上樣量10 μg。120 V恒壓電泳120 min。電泳結(jié)束后，考染液染色2 h，再用脫色液脫色3～5次，每次30 min[2]。結(jié)果提示：條帶數(shù)目繁多。見圖2。

注：M.Marker;1.TMST組；2.CGTA組。圖2 蛋白質(zhì)條帶信息

2.2 iTRAQ分析實(shí)驗(yàn)方法

大鼠心肌組織iTRAQ分析的基本流程見圖3。第一步：取等量蛋白Trypsin酶解每個(gè)樣品；第二步：用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段；第三步：對混合后的肽段使用強(qiáng)陽離子交換色譜(Strong Cation ExchangeChoematography，SCX)進(jìn)行預(yù)分離；第四步：進(jìn)行液相串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀：Q-EXACTIVE (ThermoFisher Scientific,San Jose,CA)分析[2]。

圖3 大鼠心肌組織iTRAQ分析的實(shí)驗(yàn)流程

2.3 蛋白質(zhì)分析方法

1)數(shù)據(jù)庫選擇：uniprot Rattus(36508sequences)；2)Mascot搜索Mascot2.3.02版本；3)蛋白質(zhì)豐度比分布；對每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)后作出分布如圖4。表達(dá)量上調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的右側(cè)，表達(dá)量下調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的左側(cè)。其中差異倍數(shù)大于1.2的點(diǎn)用紅色和綠色標(biāo)出(紅色為表達(dá)量上調(diào)，綠色為表達(dá)量下調(diào))[2]。這些紅色和綠色的點(diǎn)可能是潛在的差異蛋白。

圖4 TMST組/ CGTA組蛋白質(zhì)豐度比較

3 結(jié)果

3.1 CGTA組/TMST組心肌標(biāo)本的差異蛋白Pathway富集分析

CGTA組與 TMST組的差異蛋白Pathway富集分析顯示有3條通路(見表2)。3條通路分別是：補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路(Complement and coagulation cascades)、緊密連接(Tight junction)、TGF-β信號通路(TGF-betasignaling pathway)。

3.2 CGTA組/TMST組心肌標(biāo)本中差異蛋白的iTRAQ分析

蛋白質(zhì)組學(xué)只對兩組共同蛋白作分析，設(shè)定富集蛋白比值≥1.2為上調(diào)蛋白(見表3和表4)，富集蛋白比值≤0.83為下調(diào)蛋白。結(jié)果顯示：CGTA組與TMST組相比較，其中上調(diào)的蛋白12種，分別為：凝血酶3(Plastin 3)、纖蛋白5 (Fibulin-5)、半乳凝集素 (Lactadherin)、肌球蛋白11(Myosin-11)、S期激酶相關(guān)蛋白1(S-phasekinase-associated protein1)、肌球蛋白8(片段)[Myosin-8 (Fragment)]、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Serine/threonine-protein phosphatase 2A)、血管性血友病因子(片段)[Von Willebrand factor (Fragment)]、α2-抗纖溶酶(Protein Serpinf2/alpha-2-antiplasmin、Alpha-2 antiplasmin(α2-AP)) 、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(Myosin regulatory light chain RLC-A)、肝素輔助因子2(Heparin cofactor 2)。

表3 富集Pathway蛋白質(zhì)簡表

表4 富集Pathway蛋白質(zhì)詳表

3.3 差異蛋白之間的相互作用研究

將篩選出來的12個(gè)差異蛋白，利用string數(shù)據(jù)庫繪制差異蛋白功能聯(lián)系圖得到蛋白之間的相互作用(見圖5)，其中string可識別的差異蛋白為11個(gè)，Myosin-8未能識別。在string繪制的關(guān)系網(wǎng)中,肌球蛋白11(myosin-11)與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A(Myosin regulatory light chain RLC-A)之間關(guān)系最為密切。

圖5 差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

4 討論

左室肥厚是高血壓靶器官損害的最重要特征之一，也是心血管事件獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，可顯著增加心源性猝死、急性心肌梗死、心力衰竭、室性心律失常等心血管事件的發(fā)生率和病死率，嚴(yán)重影響高血壓病的預(yù)后。心肌肥厚是一個(gè)多因子、多途徑的作用的結(jié)果，單一蛋白的改變可以導(dǎo)致心肌肥厚，但是多個(gè)蛋白失衡的交互作用，可能是關(guān)鍵性要素，為此本項(xiàng)目在篩選出差異蛋白后，結(jié)合蛋白的Pathway通路，從多個(gè)蛋白角度出發(fā)，試圖從整體性層面的失衡來解釋左心室肥厚的機(jī)制及其藥物干預(yù)的機(jī)制。

4.1 多個(gè)差異蛋白參與左心室肥厚的形成

在CGTA組和TMST組之間差異蛋白分析中得到12種上調(diào)蛋白，說明予以復(fù)方鉤藤降壓片治療后12種蛋白表達(dá)增加，提示上調(diào)蛋白在左心室肥厚形成過程中發(fā)揮著重要作用。

血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)是3個(gè)主要的止血分子之一[3]，主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成。血管內(nèi)皮細(xì)胞主要通過釋放促凝和抗凝蛋白來調(diào)節(jié)凝血之間的平衡。vWF水平升高是內(nèi)皮細(xì)胞損傷或激活的標(biāo)志。內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，貯存在Weibel-Palade小體中的vWF一部分被釋放入血漿中，另一部分則向內(nèi)皮細(xì)胞的基底外側(cè)部排泌，受壓力和剪切應(yīng)力的作用，vWF被大量釋放并沉積在血管壁上[4]，改變血管結(jié)構(gòu)成分，導(dǎo)致血管壁增厚，內(nèi)皮依賴的血管舒張功能減弱，血管收縮增強(qiáng)，脈管內(nèi)血液壓力增高[5]。

纖蛋白5(Fibulin-5)是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，具有維持血管穩(wěn)定，抑制活性氧簇表達(dá)的作用[6-7]。正常情況下，F(xiàn)ibulin-5表達(dá)水平較低，在組織缺氧的情況下，F(xiàn)ibulin-5的表達(dá)水平會明顯升高。Fibulin-5的表達(dá)與動脈中內(nèi)膜厚度增加呈正相關(guān)[8]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fibulin-5廣泛分布于血管等富含彈性蛋白的組織，是彈性纖維合成的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[9]。Fibulin-5基因缺陷的小鼠動脈的彈性纖維排列會發(fā)生紊亂、斷裂，動脈內(nèi)膜彈性下降、順應(yīng)性喪失、脈壓增加，造成靶器官損傷[8]。

半乳凝集素3(Gal-3)是一種參與心肌纖維化的循環(huán)標(biāo)志物，它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，抗凋亡，參與血管形成及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能[10]。血清Gal-3水平與心肌纖維化呈顯著正相關(guān)，是與心肌重構(gòu)相關(guān)的新興標(biāo)志物[11]。Gal-3能夠刺激纖維母細(xì)胞活化，促進(jìn)心臟肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致血管周圍及心肌纖維化，引起心肌肥厚[12]。

磷酸化是蛋白常見的翻譯后修飾之一，大多數(shù)磷酸化修飾都發(fā)生在絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)上。絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPP2R1)可以被劃分為4 大類，包括 PP1、PP2A、PP2B 和 PP2C[13]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶能夠通過調(diào)節(jié)底物蛋白的磷酸化水平調(diào)節(jié)整個(gè)細(xì)胞周期，是細(xì)胞周期中負(fù)向調(diào)節(jié)的酶，在細(xì)胞的增殖與分化過程中起著重要的作用，其表達(dá)或活性異常均可以引起細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變。因此，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶被認(rèn)為是調(diào)節(jié)心血管疾病的新靶點(diǎn)[14]。

肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2 (MYL2)是心肌粗肌絲的主要成分，在心臟的發(fā)育與功能方面扮演著重要角色[15]。MYL2主要是通過磷酸化使肌球蛋白與肌動蛋白間的結(jié)合力增強(qiáng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌的收縮功能[16]。MYL2磷酸化減弱將會降低Ca2+敏感性，使得肌鈣蛋白無法結(jié)合Ca2+被激活，降低了與肌球蛋白結(jié)合的幾率，從而導(dǎo)致收縮力下降。因此，MYL2磷酸化降低可影響肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，影響心肌的收縮力[15]。國外有報(bào)道MYL2基因突變與肥厚型心肌病有關(guān)，其突變可影響粗肌絲的結(jié)構(gòu)和功能，誘發(fā)心肌肥厚，進(jìn)而導(dǎo)致肥厚型心肌病甚至慢性心力衰竭的發(fā)生[17]。

α2-抗纖溶酶(α2-AP)是血漿中主要抗纖溶物質(zhì)。α2-AP抑制以絲氨酸為活性中心的蛋白酶，如活化的凝血因子X，XI，XII，纖溶系統(tǒng)及激肽系統(tǒng)的蛋白酶。肝臟受損時(shí)α2-AP合成減少，纖溶酶的活性會增強(qiáng)[18]。α2-AP表達(dá)下調(diào)會影響肝纖維化的發(fā)生，而心室肥厚也存在心肌纖維化，因此推斷α2-抗纖溶酶也可能通過抑制表達(dá)導(dǎo)致左心室肥厚的發(fā)生[1]。

肝素輔助因子2(HCⅡ)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族之一，屬于生理性抗凝系統(tǒng)的一種新成分。當(dāng)血管內(nèi)皮發(fā)生損傷時(shí)，血漿HCⅡ即可以通過誘導(dǎo)凝血酶與HCⅡ形成復(fù)合物，從而使得凝血酶失去了蛋白水解酶的活性。當(dāng)合并有PC, AT缺乏及凝血因子V等其他危險(xiǎn)因素存在時(shí)，HCⅡ的缺乏對血栓病的發(fā)生可能起到進(jìn)一步促進(jìn)的作用[19]。血栓形成，脈管狹窄，血管內(nèi)壓力增高，促使高血壓的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致心室肌代償性肥厚。

S期激酶相關(guān)蛋白1(Skp1)是普遍存在于真核生物中的一種蛋白質(zhì)，在真核生物的細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導(dǎo)等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。Skpl可與不同種類蛋白形成復(fù)合體，作為多種生物功能的交叉點(diǎn)和限速因子，完成對代謝過程的調(diào)控[21]。S期激酶相關(guān)蛋白1水平的增高有可能激活萎縮信號通路，降解蛋白質(zhì)，逆轉(zhuǎn)肥厚心肌的產(chǎn)生。

通過string進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)節(jié)點(diǎn)(nodes)和6條邊(edges)。

其中肌球蛋白11(myosin-11)與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A(Myosin regulatory light chain RLC-A)之間關(guān)系最為密切。

心肌肌球蛋白是心肌的重要結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白，是心肌肌原纖維的主要成分，由重鏈和輕鏈組成，具有ATP酶活性。肌球蛋白11是目前已知的以肌球蛋白為基礎(chǔ)的運(yùn)動速度最快的順行性肌動蛋白，具有顯著的ATP酶活性高的特點(diǎn)[22]。肌球蛋白11的長C末端呈α-螺旋體，α-螺旋體在ATP水解時(shí)會有結(jié)構(gòu)的變化，已有研究表明肌球蛋白11與動脈內(nèi)皮損傷的形成有關(guān)。精氨酸是肌球蛋白α-螺旋體的一部分，當(dāng)MYH-11精氨酸的基因發(fā)生突變時(shí)，就會導(dǎo)致C末端螺旋結(jié)構(gòu)的斷裂，引起動脈內(nèi)層結(jié)構(gòu)紊亂變形，血管順應(yīng)性降低[23]。臨床研究表明動脈結(jié)構(gòu)紊亂發(fā)生動脈夾層的患者可能會導(dǎo)致主動脈瓣關(guān)閉不全，心室負(fù)荷壓力過大，引起左心室肥厚[24]。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A與肌球蛋白11都屬于肌球蛋白超級大家族中的蛋白質(zhì)，其功能多樣化，主要是通過催化ATP水解將釋放出來的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為推動肌動蛋白移動的機(jī)械能，為肌肉收縮提供動力[25]。肌球蛋白11與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A功能失調(diào)在心肌肥厚的發(fā)生過程中起重要作用，其磷酸化水平降低可影響肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，影響心肌的收縮力，誘發(fā)心肌肥厚。

4.2 復(fù)方鉤藤降壓片通過調(diào)節(jié)通路，干預(yù)高血壓左心室肥厚的形成

Pathway分析的結(jié)果顯示，補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、緊密連接通路以及TGF-β信號通路都存在蛋白富集現(xiàn)象，其中涉及差異蛋白數(shù)量最多的是補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、緊密連接通路。復(fù)方鉤藤降壓片由鉤藤、麥冬和川芎等組成，具有滋陰潛陽、活血通絡(luò)的功效，大量研究表明復(fù)方鉤藤降壓片在治療高血壓左心室肥厚療效顯著[26]。主要表現(xiàn)在緩解炎癥反應(yīng)，減輕過氧化刺激，抗血小板聚集，減慢心肌纖維化進(jìn)程，降低血壓緩解心室重構(gòu)等方面。

補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路屬于一種內(nèi)源性代謝級聯(lián)[27]。補(bǔ)體系統(tǒng)是血漿中的蛋白水解級聯(lián)和先天免疫的介質(zhì)，是針對病原體的非特異性防御機(jī)制。補(bǔ)體激活的主要后果是病原體的調(diào)理作用，激活后的補(bǔ)體可以調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[28]。血液凝固是另一系列酶原-絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)化，最終形成凝血酶。凝血酶是負(fù)責(zé)將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白凝塊的酶，它可以直接作用到凝血過程的最后一步，使血液成凝膠狀，失去流動性，從而形成血栓[29]。自發(fā)性高血壓的患者由于血流生物力學(xué)等刺激存在低水平的炎癥反應(yīng)，慢性炎癥反應(yīng)與心室重構(gòu)病理改變密切相關(guān)[26]。復(fù)方鉤藤降壓片以其降血壓及抗炎作用而具有靶器官保護(hù)優(yōu)勢，成為心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[30]。方中鉤藤主要依靠鉤藤堿和異鉤藤堿發(fā)揮藥效，有著抗血小板聚集、降壓、舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，麥冬主要成分為甾體皂苷類。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，麥冬可以顯著提高大鼠對缺氧的耐受力，抑制血栓形成，增強(qiáng)心肌收縮力，改善左心室功能[5]。

緊密連接是腸道機(jī)械屏障的重要組成部分，在調(diào)節(jié)腸黏膜通透性和維持上皮細(xì)胞極性中發(fā)揮著重要作用，與腸上皮細(xì)胞共同構(gòu)成腸道的選擇性屏障[31]。既往研究表明，腸道菌群能將膳食纖維降解成短鏈脂肪酸(SCFAs)，經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，作用于心臟等器官，使血壓下降[32]。維持腸道微生態(tài)平衡可能成為高血壓防治的潛在靶點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥對腸道緊密連接蛋白具有一定調(diào)控作用，以健脾、理氣及清熱類方藥頻率最高[33]，而本研究中的復(fù)方鉤藤降壓片包含菊花、石決明、夏枯草、葛根、桑寄生、女貞子等滋陰清熱的藥，契合了緊密連接通路在腸道系統(tǒng)中發(fā)揮屏障作用的機(jī)制。中醫(yī)藥作用于緊密連接通路，為通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)來調(diào)節(jié)血壓提供了新途徑，同時(shí)也符合“心與小腸相表里”中醫(yī)理論。

TGF-β信號通路在機(jī)體內(nèi)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，如增殖、凋亡、分化和遷移的作用[34]。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一員，在心臟纖維化形成的過程中扮演著重要的角色。TGF-β1/ Smads通路主要作用于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等不同的細(xì)胞，調(diào)控不同的機(jī)制，促使細(xì)胞進(jìn)入纖維化進(jìn)程，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞[35]。有學(xué)者[36]在實(shí)驗(yàn)研究中以益氣活血的中藥復(fù)方治療皮膚纖維化小鼠的成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示益氣活血湯通過作用于TGF-β1通路能夠有效地減少膠原蛋白的產(chǎn)生，治療纖維化。這在一定程度上提示益氣活血法可通過干預(yù)TGF-β1/Smads通路，減輕膠原積聚和心室肥大。復(fù)方鉤藤降壓片中的川芎性溫，味辛，具有活血行氣的功效，主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，能舒張血管平滑肌，降低血壓，擴(kuò)張冠狀動脈，同時(shí)川芎素水煎劑具有抑制炎性因子表達(dá)從而達(dá)到抗炎抗增殖的作用，可改善心肌的血氧供應(yīng)，降低心肌肥大的程度[37]。

5 結(jié)論

眾所周知，替米沙坦是降低血壓，逆轉(zhuǎn)左心室肥厚較理想的藥物[38]。本實(shí)驗(yàn)以替米沙坦為陽性對照藥物，提取心肌組織作定量分析，通過Pathway富集分析篩選出補(bǔ)體凝血級反應(yīng)、緊密連接、TGF-β三條與之相關(guān)的信號通路以及富集于三條通路中的12個(gè)差異蛋白。通過對以上相關(guān)通路和變化蛋白質(zhì)生物機(jī)制的研判，可認(rèn)為左心室肥厚發(fā)生涉及心肌細(xì)胞增殖增生、血管內(nèi)皮損傷、炎癥刺激、血栓形成等多種生物學(xué)過程[1]。同時(shí)復(fù)方鉤藤降壓片中的藥物成分可通過降低血壓、減輕過氧化刺激和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等方面干預(yù)左心室肥厚的產(chǎn)生,這為臨床上治療自發(fā)性高血壓導(dǎo)致的左心室肥厚及未病先防提供了新的思路與方法。