地龍?zhí)崛∥飳?duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠炎癥因子的影響

陳宏，張偉，郭建波，宋倩男，王偉明

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

純品百草枯進(jìn)入人體后，大部分可迅速被排泄到體外，但小部分經(jīng)消化道吸收能夠讓患者中毒，并且對(duì)全身的器官產(chǎn)生影響,其中對(duì)肺和腎兩個(gè)器官影響最大，且在這兩個(gè)臟器中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)[1]。肺泡細(xì)胞(肺泡Ⅰ型細(xì)胞和Ⅱ型細(xì)胞)對(duì)百草枯具有主動(dòng)攝取和蓄積特性，因此高濃度的百草枯會(huì)聚在肺和腎細(xì)胞中[2-3]，影響到臟器的功能運(yùn)行，對(duì)其細(xì)胞破壞力強(qiáng)，從而導(dǎo)致肺和腎功能細(xì)胞壞死[4]。近期的藥理研究表明,地龍能夠解熱，并且對(duì)支氣管作用明顯，可以抗纖維蛋白原，相關(guān)研究表明，地龍能夠在一定程度上改變肺纖維化程度，特別是對(duì)于比較嚴(yán)重的患者，效果更明顯。本研究主要觀察和評(píng)價(jià)分析地龍?zhí)崛∥飳?duì)百草枯(PQ)中毒模型小鼠肺纖維化的保護(hù)作用，并探討其對(duì)肺纖維化模型小鼠炎癥因子的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡SPF級(jí)雄性小鼠60只，體質(zhì)量18～20 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 藥品與試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[北京天根(TIANGEN)技術(shù)有限公司]；PCR引物(北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)；百草枯(PQ)(上海滬聯(lián)生物藥業(yè)有限公司，200 g/L)；維生素C注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，0.1 g/mL)；HE染色與Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TGF-β1、IL-6、IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司)。

1.3 小鼠肺纖維化模型的建立及藥物干預(yù)

40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組各10只，包括正常對(duì)照組、模型組、地龍?zhí)崛∥锝M及維生素C 組(100 mg/kg)。正常對(duì)照組小鼠進(jìn)行蒸餾水灌胃，其余各組均采用PQ液體(100 mg/kg)一次性灌胃造模。并對(duì)地龍?zhí)崛∥锝M及維生素C組進(jìn)行相應(yīng)給藥處理。

1.4 肺組織HE染色、Masson染色及評(píng)價(jià)

取小鼠右肺上葉，用4%中性甲醛固定，埋于石蠟中，切片，用HE和Masson染色。HE染色后肺組織按照Szapiel方法進(jìn)行炎癥評(píng)分，肺組織切片或小鼠炎癥病理組。Masson染色后，膠原纖維的染色和綠面積百分比(綠染膠原面積/組織整體面積)的計(jì)算方法，在連續(xù)5個(gè)隨機(jī)讀取字段視覺軟件進(jìn)行計(jì)算，作為肺纖維化程度的半定量參數(shù)。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)

按照RT-PCR法檢測(cè)方法，對(duì)各組的樣本進(jìn)行PCR試驗(yàn)，從而得到各組的相關(guān)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 ELISA檢測(cè)TGF-β1、IL-6、IL-17 蛋白表達(dá)水平

按照ELISA 檢測(cè)方法，對(duì)各組的TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表達(dá)水平,嚴(yán)格按照試劑盒上說明書進(jìn)行操作，并得到數(shù)據(jù)，進(jìn)行計(jì)算，得出各組的蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色及炎癥評(píng)分

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后第7天和第14天，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔充血，炎癥評(píng)分較正常對(duì)照組升高(P<0.05)，而地龍?zhí)崛∥锝M小鼠肺組織炎癥評(píng)分較模型組和維生素C組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組小鼠肺炎癥評(píng)分比較分)

2.2 Masson染色及纖維化程度分析

造模后第14天，地龍?zhí)崛∥锝M小鼠肺組織纖維化程度較模型組降低(P<0.05)。同時(shí)與正常對(duì)照組比較，模型組和維生素C組小鼠肺組織纖維化程度也同時(shí)存在一定的差異(P<0.05)。見表2。

表2 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組小鼠肺纖維化程度比較

2.3 TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表達(dá)水平比較

模型組TGF-β1、IL-6及IL-17蛋白表達(dá)的變化與其mRNA水平基本一致。造模后第14天，地龍?zhí)崛∥锝MTGF-β1蛋白表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)。在造模后第7天和第14天，地龍?zhí)崛∥锝MIL-6蛋白表達(dá)水平低于模型組，造模后第7天和第14天，地龍?zhí)崛∥锝M的IL-17蛋白表達(dá)水平均較模型組降低(P<0.05)。見表3。

表3 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組小鼠TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

目前，肺纖維化的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此不可能進(jìn)行有效的靶向治療[5-7]。臨床上以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為基礎(chǔ)的治療方法占主導(dǎo)地位。肺部上皮細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-8(Interleukin-8，IL-8)在肺纖維化中扮演了重要的角色[8]。另外相關(guān)文獻(xiàn)中指出細(xì)胞內(nèi)活性氧族群(Reactive oxygen species，ROS)、氧化壓力和引發(fā)的下游信息傳遞在引發(fā)的肺部發(fā)炎中也非常重要，因此，若能有效減緩引起的肺部發(fā)炎和氧化壓力，則可能改善慢性阻塞性肺部疾病的情況[9-10]。引發(fā)肺纖維化的病因有許多，包含了過敏原、化學(xué)物質(zhì)、輻射以及環(huán)境中的微粒。肺泡組織損傷、肺部發(fā)炎以及氧化壓力被認(rèn)為是造成肺纖維化的主因[11]。肺纖維化的病程，是由于一連串的損傷、發(fā)炎和損傷位置的修復(fù)愈合過程中，單一或以上的步驟調(diào)節(jié)失控所導(dǎo)致的。在肺纖維化中一項(xiàng)主要現(xiàn)象為過多的促纖維化介質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-1，TGF-β1)促使纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌纖維母細(xì)胞，進(jìn)而使膠原蛋白異常堆積[12-13]。

消除絡(luò)脈之瘀濁，保持絡(luò)脈氣血通暢和肺絡(luò)無損[14]，是治療肺纖維化及肺系絡(luò)脈病的關(guān)鍵。肺纖維化治療過程中，化學(xué)藥物的應(yīng)用治療效果不甚理想。因此，中醫(yī)學(xué)的治療或許能為肺纖維化的治療提供新的選擇。雖然地龍對(duì)肺纖維化治療作用已有文獻(xiàn)報(bào)道，但是對(duì)其藥效研究尤其是在多種肺纖維化模型上的評(píng)價(jià)并沒有系統(tǒng)研究[15]，此外，其治療肺纖維化的分子機(jī)制也尚未被闡明，這一定程度上限制了該藥物的在肺纖維化治療上的應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，造模后第7天和第14天，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔充血，炎癥評(píng)分較正常對(duì)照組升高，而地龍?zhí)崛∥锝M小鼠肺組織炎癥評(píng)分較模型組和維生素C組降低。造模后第14天，地龍?zhí)崛∥锝M小鼠肺組織纖維化程度較模型組降低。模型組TGF-β1、IL-6及IL-17蛋白表達(dá)的變化與其mRNA水平基本一致。造模后第14天，地龍?zhí)崛∥锝MTGF-β1蛋白表達(dá)水平較模型組降低。在造模后第7天和第14天，地龍?zhí)崛∥锝MIL-6蛋白表達(dá)水平低于模型組，造模后第7天和第14天，地龍?zhí)崛∥锝M的IL-17蛋白表達(dá)水平均較模型組降低。因此，地龍?zhí)崛∥锟赏ㄟ^抑制TGF-β1、IL-6和IL-17的表達(dá)來減輕PQ中毒造成的炎癥反應(yīng)和肺纖維化。