基于ERK和NF-κB途徑探討洋金花醉茄內(nèi)酯Daturataturin A抑制HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的作用

魏政，蘇慧琳，匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

洋金花是白花曼陀羅屬一年生草本植物，具有止咳平喘、止痛鎮(zhèn)靜的作用，可用于治療銀屑病，療效確切[1]。近年來的研究表明，醉茄內(nèi)酯具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]和免疫抑制[5]效應(yīng)。筆者推測洋金花中某些醉茄內(nèi)酯，尤其是Daturataturin A(DTA)可能對(duì)表皮細(xì)胞生物學(xué)具有重要影響。醉茄內(nèi)酯是一系列28C原子的甾體衍生物，在側(cè)鏈C20位置上有一個(gè)δ內(nèi)酯[6]。近年來,醉茄內(nèi)酯類化合物的抗炎和對(duì)細(xì)胞毒性的影響已有報(bào)道,NF-κB信號(hào)通路是主要的藥理靶標(biāo)，可以調(diào)節(jié)各種生理過程,如細(xì)胞增殖、發(fā)展、免疫、細(xì)胞凋亡、炎癥和代謝[6]。

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚炎癥，其主要病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖。表皮細(xì)胞NF-κB和ERK等異常激活，導(dǎo)致過度增殖、遷移、炎癥等生物學(xué)進(jìn)程。因此，本研究基于ERK和NF-κB途徑，對(duì)洋金花醉茄內(nèi)酯Daturataturin A(DTA)誘導(dǎo)HaCaT增殖、遷移、炎癥及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究，從而探討其治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

抗體NF-кB、抗體ERK、抗體p-ERK、抗體PCNA、HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-6、IL-8和 TNF-α ELISA試劑盒、CCk-8試劑(南京恩晶生物科技有限公司)。

1.2 洋金花的提取分離和Daturataturin A的精制

取干燥洋金花，用40倍量70%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，合并提取液，冷卻至室溫，靜置，濾過。濾液回收溶劑至濃縮液無醇味后，用0.1%的鹽酸溶液5倍于濃縮液體積浸提6～8次，濾過。將此濾液進(jìn)行732型陽離子交換樹脂柱色譜，流速3 BV/h，流出液繼續(xù)進(jìn)行AB-8型大孔吸附樹脂柱色譜，流速2.5 BV/h，吸附完全后用純水將樹脂洗至流出液還原糖反應(yīng)陰性，用50%乙醇4 BV洗脫，最后用95%乙醇洗脫回收溶劑。結(jié)合前期藥理學(xué)及化學(xué)成分研究，其中水洗脫部分主要含有水溶性雜質(zhì)，95%乙醇洗脫部分主要含有脂溶性色素。50%乙醇洗脫組分中主要含有黃酮類化合物和甾體類化合物，是治療銀屑病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，即經(jīng)大孔樹脂得洋金花50%乙醇洗脫組分。

對(duì)50% EtOH洗脫部分以葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜進(jìn)一步分離，依次用水、MeOH進(jìn)行洗脫，得到水洗脫組分(醉茄內(nèi)酯類化合物)和甲醇洗脫組分(黃酮類化合物)。采用反相柱色譜和HPLC等現(xiàn)代方法對(duì)水洗脫組分進(jìn)行分離，得到精制的Daturataturin A。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以2.5%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞；48 h更換新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.4 增殖、遷移、抗炎實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測并分析藥物的量-效關(guān)系和時(shí)-效關(guān)系；WST-1、中性紅、結(jié)晶紫聯(lián)合測試藥物對(duì)細(xì)胞不同細(xì)胞器靶點(diǎn)的影響；HaCaT細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)測試DTA的抗增殖效應(yīng);細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞劃痕法和transwell法;ELISA法檢測炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α 的表達(dá)情況。

1.5 免疫蛋白印跡法檢測ERK、NF-κB、PCNA的表達(dá)

將細(xì)胞消化后，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，均勻的分裝至25 cm2培養(yǎng)瓶，使用相應(yīng)完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。至細(xì)胞鋪滿80%，加入相應(yīng)劑量的含藥物的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h或48 h，收獲細(xì)胞。細(xì)胞裂解在4 ℃進(jìn)行，所有試劑均預(yù)冷。首先，以PBS(pH值7.4)洗細(xì)胞，孵育在新鮮添加1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(含Na3VO4100 mmol/L，PMSF 1 mmol/L)30 min，每瓶600 μL。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，4 ℃，13 000×g離心20 min，取上清液。BCA法測定蛋白質(zhì)含量。加入4×負(fù)載緩沖液后，煮沸5 min，將15 μg蛋白裝入聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(SDS-PAGE)。利用圖像分析軟件(Analytik Jena, Jena，德國)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，確定目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值。核蛋白的提取按照制造商的說明書(solarbio，北京)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若P>0.05,則方差具有齊性，多組比較釆用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-ttest ；若P<0.05，則方差不齊，采用單因素方差分析，并使用Brown-Forsythe或Welch校正，兩兩比較采用Durmett’s T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P≤0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并應(yīng)用Prism 5顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的直方圖。

2 結(jié)果

2.1 DTA抑制HaCaT增殖呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系

首先，應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)測定DTA(化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1f所示)對(duì)HaCaT抑制活性的量-效和時(shí)-效作用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，單次實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每隔6 h設(shè)為測試的時(shí)間點(diǎn)，并應(yīng)用Prism 5利用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差擬合量-效曲線。DTA 30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L對(duì)HaCaT呈量效依賴的抑制作用(圖1a、圖1c和表1、表2)。 24 h和48 h的IC50分別為32.74 μmol/L和26.07 μmol/L(圖1b、圖1d)。30 μmol/L DTA對(duì)HaCaT的抑制活性隨時(shí)間遞增，大約在24 h起到明顯抑制增殖作用(圖1e和表3)。

注：a.24 h CCK-8實(shí)驗(yàn)；b.24 h量效曲線；c.48 h CCK-8實(shí)驗(yàn)；b.48 h量效曲線；e.30 μmol/L DTA的時(shí)效曲線；f.Daturataturin A化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1 DTA抑制HaCaT活性的初步研究

表1 DTA作用于HaCaT細(xì)胞24 h的增殖抑制率

表2 DTA作用于HaCaT細(xì)胞48 h的增殖抑制率

表3 DTA在不同時(shí)間點(diǎn)作用于HaCaT細(xì)胞的增殖抑制率

克隆形成實(shí)驗(yàn)是比較敏感的測定細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)方法。利用多功能成像儀 (Analytik Jena,Jena，德國)及其配套的圖像分析軟件拍攝并計(jì)算克隆形成率。細(xì)胞以單個(gè)分散的形式接種在6孔板內(nèi)，數(shù)日后，單個(gè)細(xì)胞不斷復(fù)制形成克隆，計(jì)算克隆形成率，可以直觀的反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力。腫瘤細(xì)胞大多具有克隆生長的能力，HaCaT細(xì)胞是永生化的表皮細(xì)胞，也具有較弱的克隆能力。在克隆形成實(shí)驗(yàn)，7.5 μmol/L DTA能夠明顯抑制HaCaT增殖(P<0.05)，然而30 μmol/L DTA幾乎完全抑制克隆形成(圖2a、圖2b和表4)。

圖2 DTA抑制HaCaT細(xì)胞克隆形成

表4 DTA影響HaCaT細(xì)胞克隆形成率

2.2 DTA抑制IL-17誘導(dǎo)的HaCaT過度增殖

以IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞作為銀屑病模型，研究DTA的抗增殖作用。在同一個(gè)96孔板樣本中，采用WST1、中性紅、結(jié)晶紫三聯(lián)測，分別顯示DTA對(duì)線粒體、溶酶體、細(xì)胞膜三個(gè)細(xì)胞器靶點(diǎn)的作用。我們發(fā)現(xiàn)IL-17 50 ng/mL可誘導(dǎo)HaCaT過度增殖(P<0.05)；DTA 7.5 μmol/L (P<0.05), 15 μmol/L (P<0.05) 和30 μmol/L (P<0.01)可劑量依賴的逆轉(zhuǎn)這種趨勢(圖3a、圖3b、圖3c和表5、6、7)。三個(gè)不同的細(xì)胞器靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)顯示，DTA 7.5 μmol/L對(duì)溶酶體的抑制并無顯著意義，提示溶酶體中可能存在其他細(xì)胞保護(hù)作用的生物學(xué)進(jìn)程(圖3b和表6)。

注：a. WST-1;b.中性紅;c.結(jié)晶紫依次在一個(gè)樣本中的連續(xù)測試;IL-17(50 ng/mL)添加到除空白組之外的各實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，單次實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。圖3 WST-1、中性紅、結(jié)晶紫三聯(lián)測試DTA抑制過度活化的HaCaT

表5 WST-1測試DTA抑制HaCaT細(xì)胞的過度增殖

表6 中性紅測試DTA抑制HaCaT細(xì)胞的過度增殖

表7 結(jié)晶紫測試DTA抑制HaCaT細(xì)胞的過度增殖

2.3 DTA抑制HaCaT的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示DTA抑制HaCaT劃痕愈合能力(圖4a、圖4b和表8)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示了DTA可抑制HaCaT單細(xì)胞遷移(圖4c、圖4d和表9)。Transwell實(shí)驗(yàn)拍攝照片后，用33%乙酸抽提樣本，酶標(biāo)儀測520 nm波長吸光度，OD值代表遷移細(xì)胞的相對(duì)含量，結(jié)果顯示與鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法相似(圖4e和表10)。

檢測到30 μmol/L DTA可抑制總ERK的表達(dá)(P<0.05)，磷酸化的ERK可劑量依賴式的被DTA抑制(7.5 μmol/L；15 μmol/L,P<0.05；30 μmol/L,P<0.01)(圖5a、圖5b和表11)。

注：a和b為24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)；c、d、e為12 h Transwell實(shí)驗(yàn);與Control比較， *P<0.05，**P<0.01。圖4 DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移

注：與Control比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移的始動(dòng)因子ERK

表8 DTA抑制HaCaT細(xì)胞劃痕愈合

表9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移計(jì)數(shù)

表10 Transwell實(shí)驗(yàn)聯(lián)合結(jié)晶紫抽提檢測DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移的相對(duì)計(jì)數(shù)

表11 免疫印跡檢測DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移的始動(dòng)因子ERK和p-ERK與內(nèi)參的比值

2.4 DTA抑制持續(xù)活化的NF-κB

作為炎癥信號(hào)分子，NF-κB在多種腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)，同時(shí)，抑制NF-κB會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性減弱。Cyclin D1是NF-κB的下游信號(hào)，表明炎癥信號(hào)和增殖信號(hào)之間的關(guān)系[7]。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子,隨后對(duì)細(xì)胞的增殖,存活和炎癥反應(yīng)有一系列的影響。筆者發(fā)現(xiàn)HaCaT細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)NF-κB，免疫熒光顯示強(qiáng)烈的NF-κB細(xì)胞核染色信號(hào)，這可能與HaCaT細(xì)胞永生化的特性有關(guān)。隨著DTA(15 μmol/L,30 μmol/L,P<0.05)用量增加，在24 h，NF-κB免疫染色平均光密度顯著降低，30 μmol/L DTA組NF-κB信號(hào)幾乎完全消失(圖6a、圖6b和表12)。DTA(7.5 μmol/L, 15 μmol/L,P<0.05；30 μmol/L,P<0.01)可顯著降低核內(nèi)NF-κB/p65的表達(dá)(圖6d和表12)。此外，PCNA在S期DNA合成是必需的，DTA(15 μmol/L,30 μmol/L,P<0.05)降低PCNA免疫染色平均光密度(圖6a、圖6c和表12)；DTA(7.5 μmol/L, 15 μmol/L,P<0.05；30 μmol/L,P<0.01)可顯著降低核內(nèi)PCNA的表達(dá)(圖6e和表12)。

炎癥因子分泌的ELISA測定，顯示30 μmol/L DTA可顯著降低IL-6、IL-8、TNF-α的分泌(圖7a、圖7b、圖7c和表13)，其抗炎作用與抗銀屑病藥物Tretinoin (1 μmol/L)(P<0.05)相似。

表12 免疫印跡和免疫熒光檢測DTA抑制HaCaT細(xì)胞NF-κB和PCNA的表達(dá)

注：與Control比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 DTA 抑制持續(xù)活化的 NF-κB和下游的增殖信號(hào)

注：與Control比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 DTA抑制分泌性的炎癥因子

表13 ELISA 檢測DTA作用下的HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8和TNF-α 的分泌

3 討論

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚炎癥，其主要病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖。銀屑病的臨床表型有尋常型銀屑病、斑點(diǎn)狀銀屑病、反向銀屑病、紅皮病型牛皮癬和膿皰性銀屑病[8]?，F(xiàn)已經(jīng)提出許多假說來推測銀屑病可能的病理模型。銀屑病的臨床表現(xiàn)為厚鱗屑，并伴有組織病理學(xué)改變，是以表皮角化為主要特征的一種疾病。然而，銀屑病病理生理學(xué)的發(fā)現(xiàn)揭示了這種紊亂機(jī)制,角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖是銀屑病的重要機(jī)制之一。

近年來提出了一種涉及IL-23/Th17免疫軸的銀屑病致病模型[9]。在與這個(gè)軸相關(guān)的分子中，IL-17是影響銀屑病的關(guān)鍵因子，并已開發(fā)出針對(duì)其的相應(yīng)生物制劑[10-11]。IL-17激活核factor-kappa B (NF-κB)信號(hào)通路，并引起下游一系列細(xì)胞增殖和炎癥進(jìn)程。本研究顯示DTA可抑制IL-17誘導(dǎo)的HaCaT過度增殖，可能是治療銀屑病的機(jī)制之一。

表皮角質(zhì)形成細(xì)胞作為原駐的天然免疫細(xì)胞，可防御外來的有害物質(zhì)侵襲，充當(dāng)免疫衛(wèi)兵的作用。激活的 NF-κB是一個(gè)含有p65和p50亞基二聚體的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB經(jīng)IκB激酶誘導(dǎo)后與IκB分離，進(jìn)入到細(xì)胞核而影響特殊靶基因序列。多種刺激可以激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括TNF-α、IL-1、IL-17、病毒和脂多糖。銀屑病患者皮損處相比于健康者 NF-κB表達(dá)上調(diào)[12]。作為炎癥關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素，NF-κB可以調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和酶的轉(zhuǎn)錄。也影響炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8。此外，NF-κB激活能影響角質(zhì)細(xì)胞在銀屑病皮損中的分化和增殖[13]。NF-κB是天然免疫的主要信號(hào)途徑，銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞的產(chǎn)生與反應(yīng)異常的炎性細(xì)胞因子有關(guān)，包括TNF-α， IL-6和IL-8[9]，本研究顯示了DTA可抑制持續(xù)活化的NF-κB及其下游的炎癥因子。

蛋白激酶是信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，可以使細(xì)胞作為有機(jī)體的一個(gè)組成部分發(fā)揮作用。胞外信號(hào)激酶ERK(Extracellular signaling kinase, ERK)，磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，參與了細(xì)胞增殖[14]和遷移[15]的多種進(jìn)程。ERK和NF-κB存在著交互作用，本研究顯示DTA抑制ERK的磷酸化水平，進(jìn)而抑制HaCaT增殖、遷移和炎癥進(jìn)程。

醉茄內(nèi)酯是一類廣泛存在于茄科植物中的有活性的化合物。隨著分子結(jié)構(gòu)和藥理研究的進(jìn)展，其具有良好的抗癌作用的報(bào)道越來越多。茄科植物分布廣泛，為其天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和藥理研究提供了大量資源。筆者研究結(jié)果揭示了洋金花醉茄內(nèi)酯DTA可有效抑制HaCaT增殖和遷移，其機(jī)制可能是通過抑制炎癥信號(hào)分子NF-κB和ERK進(jìn)行的。這可能是洋金花制劑治療銀屑病的作用機(jī)制之一。