袁 河 肖曉義, -, 劉 佳 趙志友 - 夏延斌 -
(1. 湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心,湖南 湘潭 411100;2. 湖南賓之郎食品科技有限公司檢測中心,湖南 湘潭 411100;3. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,湖南 長沙 410128)
檳榔是棕櫚科植物檳榔干燥成熟種子,含有人體所需的生物堿、多酚、氨基酸以及不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)成分和活性成分[1]。檳榔主要種植在中國的海南和臺灣,海南95%以上的檳榔以干果的形式直接銷往湖南加工成食用檳榔(亦稱檳榔嚼塊)[2]。食用檳榔在加工過程中,為了保證食用檳榔的安全性和可口性,根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》,食用檳榔添加量適用于話化類標準,山梨酸和苯甲酸最大添加量不得超過0.5 g/kg,糖精鈉最大添加量不得超過5 g/kg。因此如何客觀準確地測量其含量對企業(yè)防腐劑的添加具有指導作用,而檳榔成分復雜且加工時會添加數(shù)十種添加劑,增加了準確測量的難度?,F(xiàn)有研究[3-4]多是檢測檳榔中多種食品添加劑的含量,并未對其不確定進行評定。
為了能夠直觀反映各個分量對測量結(jié)果的分散性,試驗擬依據(jù)GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》開展試驗,依據(jù)不確定度評定的相關(guān)準則[5-6],建立模型,對整個操作過程中產(chǎn)生不確定度進行分析得到相對標準不確定度。
乙酸銨:分析純,湖南匯虹試劑有限公司;
甲醇:色譜純,美國天地(TEDIA)試劑公司;
高效液相色譜儀:LC-20A型,配DAD檢測器,株式會社島津制作所;
超聲波清洗機:型號KQ-700E,昆山美美超聲儀器有限公司;
分析天平:型號EX125DZH,奧豪斯儀器(常州)有限公司;
賓之郎爆珠檳榔:市售;
苯甲酸(CAS號:65-85-0):99.0%,中國食品藥品檢定研究院;
山梨酸(CAS號:110-44-1):99.8%,中國食品藥品檢定研究院;
糖精鈉標準品(CAS號:128-44-9):99.9%,中國食品藥品檢定研究院。
采用GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中第一法(高效液相色譜法)對食用檳榔中苯甲酸、山梨酸及糖精鈉含量進行測定。
準確稱取約2 g(精確到0.001 g)試樣于50 mL具塞離心管中,加水約25 mL,渦旋混勻,于50 ℃水浴超聲20 min,冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,于殘渣中加水20 mL,渦旋混勻后超聲5 min,于8 000 r/min離心5 min,將溶液轉(zhuǎn)移到同一容量瓶中,并用水定容至刻度,混勻。取適量上清液過0.22 μm濾膜,待液相色譜儀測定。
試樣中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的含量按式(1)計算:
(1)
式中:
X——食用檳榔中待測組分含量,g/kg;
ρ——樣品溶液中待測組分的濃度,mg/L;
V——試樣定容體積,mL;
m——試樣質(zhì)量,g。
根據(jù)試驗方法可知,食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量測定的不確定度包括:① 標準溶液的配制;② 標準曲線的擬合;③ 樣品定容;④ 樣品稱量;⑤ 回收率及儀器隨機效應(yīng)。
分別稱取苯甲酸標準品59.32 mg、山梨酸標準品30.55 mg、糖精鈉標準品85.69 mg于50 mL容量瓶中,將苯甲酸、山梨酸標準品用甲醇溶解并定容,糖精鈉用超純水溶解定容。從3種標準儲備液中分別取5 mL置于同一50 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,即為標準母液。
上述操作中不確定度來源于標準物質(zhì)純度、稱量及容量瓶定容。
4.1.1 標準物質(zhì)引入的不確定度 根據(jù)中檢院給出的標準物質(zhì)純度為99.0%,99.8%,99.9%,按矩形分布,則其相對標準不確定度分別為:
4.1.2 稱量引入的不確定度 分析天平精確至0.000 01 g,區(qū)間半寬度αm=0.005 mg,假設(shè)其為矩形分布,標準不確定度為:
稱取苯甲酸標準品59.32 mg、山梨酸標準品30.55 mg、糖精鈉標準品85.69 mg,則稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度為:
urel苯(m)= 2.89×10-3/59.32=4.87×10-5;
urel山(m)= 2.89×10-3/30.55=9.46×10-5;
urel糖(m)= 2.89×10-3/85.69=3.37×10-5。
4.1.3 定容引入的不確定度
(1) 容器及移液引入的不確定度:根據(jù)中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程[7],(25±1) ℃時,50 mL單標線容量瓶(A級)容量允差為±0.05 mL,5 mL (B級)單標線移液管允差為0.030 mL,假設(shè)其為矩形分布,則
(2) 溫度引入的不確定度:實驗室溫度在(20±5) ℃之間變化,溶液溫度與校準溫度(20 ℃)不同所引起的變化為5 ℃×2.08×10-4℃-1=1.04×10-3(2.08×10-4℃-1為水的膨脹系數(shù)),假設(shè)其為矩形分布,則
溫度對定容體積影響所引入的不確定度為:
定容及移液引入的相對標準不確定度為:
由此得出標準物質(zhì)的配制引入的相對標準不確定度為:
4.2.1 移取定容引入的不確定度
(1) 移液管引入的不確定度:分別用10 mL移液管準確吸取苯甲酸、山梨酸和糖精鈉混合標準中間溶液0.5,2.0,4.0,6.0,8.0 mL置于10 mL容量瓶中,加入超純水定容至刻度,搖勻后配制成苯甲酸濃度為5.9,13.7,47.5,71.2,94.9,118.6 mg/L;山梨酸濃度為3.1,12.2,24.4,36.7,48.9,61.1 mg/L;糖精鈉濃度為8.6,34.3,68.6,102.8,137.1,171.4 mg/L的混合標準工作液。10 mL分度移液管(A級)允差為±0.02 mL,假設(shè)其為矩形分布,則
(2) 容量瓶引入的不確定度:10 mL單標線容量瓶(A級)容量允差為±0.025 mL,假設(shè)其為矩形分布,則
移取定容引入的相對標準不確定度為:
4.2.2 標準曲線擬合引入的不確定度 根據(jù)HPLC檢出濃度和峰面積之間的關(guān)系如表1所示。
表1 濃度與峰面積關(guān)系
采用最小二乘法對濃度x和峰面積y進行線性回歸計算,得到苯甲酸標準曲線為y=32.534 7x-6.605 2,r=0.999 9;山梨酸標準曲線為y=63.799 7x-16.607 3,r=0.999 8;糖精鈉標準曲線為y=22.411 4x-1.719 2,r=0.999 9。
則由標準曲線擬合引入的標準不確定度為:
(2)
式中:
s(A)——工作液峰面積殘差的標準差;
Scc——溶液含量殘差的平方和;
n——測量次數(shù);
p——濃度梯度,mg/L;
a——標準曲線的斜率,苯甲酸、山梨酸、糖精鈉斜率分別為32.534 7,63.799 7,22.411 4;
b——標準曲線截距,苯甲酸、山梨酸、糖精鈉截距分別為6.605 2,16.607 3,1.719 2。
標準曲線擬合得相對標準不確定度按式(3)計算:
(3)
標準不確定度u(q)和相對標準不確定度urel(q)如表2 所示。
表2 標準曲線不確定度結(jié)果分析
由此得出標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為:
4.3.1 容器定容引入的不確定度 樣品溶液定容于25 mL
容量瓶中,容量瓶(量入式,A級)容量允差為±0.03 mL,按矩形分布,則
4.3.2 溫度引入的不確定度 溫度代入的體積影響為25 mL×5 ℃×2.08×10-4℃-1=2.6×10-2mL,假設(shè)為矩形分布,則
樣品定容引入的相對標準不確定度為:
稱取粉碎后的賓之郎爆珠檳榔2 g,考慮到稱量分兩次進行,分析天平最大的允差為0.000 5 g,假設(shè)為矩形分布,則
(4)
(5)
(6)
(7)
式中:
n——測量次數(shù),n=9。
經(jīng)計算提取過程不確定度結(jié)果如表3所示。
表3 提取過程不確定度結(jié)果分析
用同一樣品做6個平行得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的平均含量,取矩形分布,則
(8)
urel(crep)=u(crep)/c。
(9)
經(jīng)計算隨機效應(yīng)不確定度結(jié)果如表4所示。
表4 隨機效應(yīng)不確定度結(jié)果分析
綜上所述,相對標準不確定度如表5所示。
表5 各個分量相對標準不確定度匯總
上述各分量相對不確定度合成標準不確定度為:
在95%置信區(qū)間下,取包含因子k=2,得相對擴展不確定度為:
Urel苯(X)=k×urel(x)=2×0.049 3=0.098 6;
Urel山(X)=k×urel(x)=2×0.059 0=0.118;
Urel糖(X)=k×urel(x)=2×0.030 8=0.061 6。
得擴展不確定度為:
U苯=0.043 8 g/kg×0.098 6=0.004 10 g/kg;
U山=0.260 g/kg×0.118=0.030 7 g/kg;
U糖=3.25 g/kg×0.061 6=0.200 g/kg。
綜上可得:食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量測定結(jié)果為:
X苯=(0.043 8±0.004 10) g/kg (k=2);
X山=(0.260±0.030 7) g/kg (k=2);
X糖=(3.25±0.200) g/kg (k=2)。
通過對食用檳榔檢測過程中標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品定容、樣品稱量、回收率及儀器隨機效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度進行分析。測定苯甲酸含量中標準曲線擬合和隨機效應(yīng)代入的不確定度分別為67.5%,17.9%;測定山梨酸和糖精鈉含量中標準曲線擬合的不確定度分別為80.7%,10.1%,提取過程代入的不確定度分別為70.2%,15.8%。因此在今后的檢測工作中,針對標準曲線擬合代入不確定度的問題應(yīng)該增加標準系列儲備液的測定次數(shù)、使用精密度更高的量器具和合理確定標液濃度的區(qū)間范圍;其次是隨機效應(yīng)和提取過程代入的不確定度的問題應(yīng)該加強操作人員的熟練度、規(guī)范試驗操作,減少人為因素對提取過程的影響,從而提高檢測結(jié)果的準確性。