超高效液相色譜—四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速測(cè)定草魚(yú)中7種激素

周艷華 - 李 濤 張鵬飛 -

(1. 長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111；3. 湖南湘典食品有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410031)

草魚(yú)為中國(guó)重要淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，年產(chǎn)量連續(xù)多年位居首位，水產(chǎn)品中藥物殘留一直是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。雄激素和孕激素是類(lèi)固醇激素，能影響動(dòng)物性別分化，具有強(qiáng)而持久的蛋白同化作用，可促進(jìn)動(dòng)物超常態(tài)生長(zhǎng)，大幅提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[1-2]，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[3]。食用含有激素殘留的水產(chǎn)品會(huì)干擾人體正常激素平衡，影響人體正常代謝功能，導(dǎo)致發(fā)育異常，具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)以及較大的危害性[4-5]。為保障食品安全，農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告和GB 31650—2019規(guī)定了水產(chǎn)品中不得檢出雄激素、孕激素類(lèi)藥物殘留。

目前，雄激素、孕激素檢測(cè)主要有液相色譜法[6-7]、氣質(zhì)聯(lián)用法[8-10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]等。高效液相色譜法靈敏度低，檢測(cè)項(xiàng)目單一，定性分析易受干擾；氣質(zhì)聯(lián)用法需進(jìn)行衍生化反應(yīng)，操作繁雜；液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇好、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但前處理方法繁雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，回收率低，而采用QuEChERS凈化工藝，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢驗(yàn)效率。近年來(lái)，以四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜和四級(jí)桿/軌道阱質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜技術(shù)具有高特異性、高準(zhǔn)確度和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)[13]，已應(yīng)用于農(nóng)藥殘留[14]、獸藥殘留[15-16]及保健食品非法添加[17]等領(lǐng)域，但未見(jiàn)應(yīng)用于草魚(yú)中雄激素、孕激素的檢測(cè)。

試驗(yàn)擬對(duì)草魚(yú)基質(zhì)中7種雄激素和孕激素類(lèi)藥物殘留進(jìn)行檢驗(yàn)研究，優(yōu)化其提取試劑與提取方法，采用QuEChERS凈化工藝替代傳統(tǒng)固相萃取凈化法，并應(yīng)用空白基質(zhì)匹配法替代內(nèi)標(biāo)法，采用四級(jí)桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜替代傳統(tǒng)液相質(zhì)譜檢測(cè)7種激素，建立一種草魚(yú)中7種激素藥物殘留的快速檢測(cè)方法，并進(jìn)行方法有效性研究，評(píng)價(jià)其7種激素的基質(zhì)效應(yīng)，旨在為利用高分辨質(zhì)譜測(cè)定雄激素、孕激素的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮草魚(yú)：市售；

Hypersil Gold C18色譜柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó) CNW公司；

甲酸：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

NH2萃取劑、C18萃取劑、HLB萃取劑：40～63 μm，60 A，德國(guó)CNW公司；

丙酸睪酮(CAS 57-85-2，純度99.7%)、甲睪酮(CAS 58-18-4，純度98.0%)、睪酮(CAS 58-22-0，純度98.5%)、勃地酮(CAS 846-48-0，純度98.5%)、諾龍(CAS 434-22-0，純度99.0%)、群勃龍(CAS 10161-33-8，純度96.3%)、孕酮(CAS 57-83-0，純度99.3%)標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜：Q Exactive Focus型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

電子分析天平：ME204E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：JXN-26型，貝克曼庫(kù)爾德(美國(guó))股份有限公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

HESI離子源下，采用PRM/Targeted-MS2掃描， 掃描范圍m/z50～400，分辨率35 000，毛細(xì)管電壓3 000 V；電噴霧離子源溫度325 ℃，汽化溫度360 ℃；鞘氣壓0.24 kPa；輔助氣壓0.091 kPa；離子傳輸管溫度325 ℃；噴霧電壓4.0 kV。取標(biāo)準(zhǔn)溶液直接質(zhì)譜，通過(guò)Full MS掃描確定電離模式和母離子m/z，通過(guò)SIM掃描確定定量離子和定性離子。

1.4 液相色譜條件優(yōu)化

相同洗脫程序和色譜柱條件下，選擇0.1%甲酸溶液為無(wú)機(jī)流動(dòng)相，甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈為有機(jī)流動(dòng)相，考察分離效果。色譜柱Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)，流動(dòng)相A為無(wú)機(jī)流動(dòng)相，流動(dòng)相B為有機(jī)流動(dòng)相；采用梯度洗脫模式(見(jiàn)表1)進(jìn)樣；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.5 樣品前處理工藝優(yōu)化

1.5.1 提取劑 取草魚(yú)可食用部分充分勻漿，精密稱取2.0 g于50 mL離心管中，平行樣6份，加入提取劑10 mL，振搖1 min，超聲15 min，離心，取上清液，殘?jiān)尤?0 mL提取劑，振蕩搖勻15 min，離心，合并上清液，混勻，冷凍2 h，高速冷凍離心，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算平均回收率。分別選擇甲醇、乙腈、1%甲酸—乙腈進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳提取劑。

1.5.2 凈化劑 最優(yōu)提取條件下獲取樣品提取液4.0 mL，萃取劑種類(lèi)選擇分別加入200 mg C18、HLB、NH2萃取劑，平行樣6份，萃取劑用量組分別加入100，200，300 mg C18萃取劑，平行樣6份，振蕩混勻，高速離心，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算平均回收率。

1.6 線性范圍、檢出限和定量限測(cè)定

取空白樣品按最優(yōu)前處理工藝制備空白基質(zhì)溶液，配制1.0～100.0 ng/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白草魚(yú)樣品中添加低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品制備方式處理，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)，化合物測(cè)定S/N≥3的濃度為檢出限，S/N≥10的濃度為定量限。

1.7 準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定

空白草魚(yú)樣品中加入7種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)后樣品濃度分別為2.0，4.0，20.0 μg/kg，每個(gè)濃度樣品制備6份，測(cè)定7種激素含量，計(jì)算回收率和RSD值。

1.8 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

取空白草魚(yú)基質(zhì)樣品，按最優(yōu)前處理工藝處理樣品后，配制空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定后得空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)取溶劑配制與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度一致的溶劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定得溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。根據(jù)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

1.9 草魚(yú)樣品檢測(cè)

依據(jù)上述最優(yōu)樣品前處理工藝進(jìn)行處理，最優(yōu)儀器條件下檢測(cè)樣品中7種激素，質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)采用保留時(shí)間進(jìn)行定性，結(jié)合離子豐度比和二級(jí)特征離子進(jìn)行確證。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由表2可知，7種激素在正離子模式下響應(yīng)值最高，得到的化合物母離子質(zhì)荷比均為[M+H]+。其中丙酸睪酮、甲睪酮、睪酮和孕酮具有相同的碎片離子，且定量與定性離子相同。

表2 7種激素的質(zhì)譜參數(shù)表?

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

由圖1知，甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈均能分離7種激素，且目標(biāo)物在10 min內(nèi)得到了有效分離，其中0.1%甲酸—乙腈的分離效果及響應(yīng)值最高。目標(biāo)化合物極性小，易與C18色譜柱結(jié)合，乙腈洗脫能力強(qiáng)于甲醇，出峰時(shí)間更快，乙腈分離效果優(yōu)于甲醇。目標(biāo)化合物采用正離子模式分析，加入低濃度甲酸有利于提供正電荷，離子化效率大大提高，因此，0.1%甲酸—乙腈響應(yīng)度高于乙腈。

圖1 7種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖

2.3 提取劑優(yōu)化

由圖2可知，3種提取劑中，1%甲酸—乙腈提取的目標(biāo)化合物回收率最高，甲醇提取的回收率最低。甲醇提取時(shí)，水溶性蛋白進(jìn)入提取液影響了目標(biāo)化合物的電離，回收率不高。乙腈具有沉淀蛋白作用，降低了提取液中基質(zhì)的干擾，在酸性環(huán)境下更有利于雄激素和孕酮的提取。試驗(yàn)采用二次提取法，充分提取了樣品中目標(biāo)化合物，保證了最佳提取效果。樣品提取液冷凍后，脂肪轉(zhuǎn)換為固態(tài)，通過(guò)離心去除后可有效降低提取液中基質(zhì)干擾，提高目標(biāo)物回收率。

圖2 提取劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.4 凈化條件的優(yōu)化

由圖3可知，3種凈化劑中，使用NH2和C18凈化后，目標(biāo)化合物回收率為75%～110%，C18凈化劑凈化后回收率高于NH2；而使用HLB凈化劑后，僅丙酸睪酮回收率>60%，其他化合物回收率均<60%，表明HLB凈化劑對(duì)目標(biāo)化合物有吸附作用。C18吸附劑能去除脂肪和酯類(lèi)等非極性干擾物，故選擇C18凈化劑作為凈化工藝凈化劑。

圖3 吸附劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

由圖4可知，相同體積提取液中，當(dāng)C18凈化劑用量為200 mg時(shí)，目標(biāo)化合物回收率最高；當(dāng)C18凈化劑用量為100 mg時(shí)，凈化劑量少而凈化效果差，目標(biāo)化合物回收率最低；當(dāng)C18凈化劑用量為300 mg時(shí)，目標(biāo)化合物回收率低于凈化劑用量為200 mg的，表明過(guò)多的凈化劑會(huì)吸附部分目標(biāo)化合物，且增加檢測(cè)成本。故C18凈化劑的最適用量為200 mg。

圖4 C18吸附劑用量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.5 線性范圍、檢出限和定量限分析

由表3可知，當(dāng)激素濃度為1.0～100.0 ng/mL時(shí)，7種激素線性關(guān)系良好(R2≥0.998)，檢出限為0.04～0.60 μg/kg，定量限為0.2～1.8 μg/kg，表明利用基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液能有效降低基質(zhì)增強(qiáng)與抑制效應(yīng)，可準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)化合物含量。

表3 7種激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 準(zhǔn)確度和精密度分析

由表4可知，當(dāng)加標(biāo)濃度為2.0 μg/kg時(shí)，回收率為71.4%～103.5%，RSD為4.8%～7.8%；當(dāng)加標(biāo)濃度為4.0 μg/kg時(shí)，回收率為79.4%～106.9%，RSD為2.4%～7.6%；當(dāng)加標(biāo)濃度為20.0 μg/kg時(shí)，回收率為81.0%～106.5%，RSD為4.1%～6.2%。3個(gè)梯度加標(biāo)回收率和精密度良好，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，能滿足草魚(yú)實(shí)際樣品中雄激素和孕激素的檢測(cè)要求。

表4 7種激素的回收率和精密度

2.7 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

由圖5可知，7種激素均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，且比值均<80%，表明此方法檢測(cè)草魚(yú)中7種雄激素和孕激素呈強(qiáng)抑制效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)與液相串聯(lián)質(zhì)譜特性相關(guān)，不能完全消除基質(zhì)效應(yīng)，在評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，可通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法、使用合適的內(nèi)標(biāo)、采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正等方式降低和補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，從而獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)法成本昂貴，試驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

圖5 7種激素的基質(zhì)效應(yīng)

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用試驗(yàn)建立的檢驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)采購(gòu)的20批次鮮活草魚(yú)進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出上述7種雄激素、孕激素。

3 結(jié)論

建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)草魚(yú)中7種雄激素、孕激素的方法，優(yōu)化了前處理方法中的提取工藝與凈化工藝，建立了QuEChERS樣品處理方法，并對(duì)線性方程、檢出限、定量限、回收率等方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，試驗(yàn)方法相較于SN/T 4744—2017和農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008 SPE凈化法，大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，降低了檢驗(yàn)成本，且回收率更高，能滿足草魚(yú)實(shí)際樣品中雄激素和孕激素的檢測(cè)要求。試驗(yàn)在QuEChERS樣品前處理工藝中缺少?gòu)?fù)配凈化劑研究，檢驗(yàn)方法的多基質(zhì)樣品適用性研究不夠。